根霉源酸性蛋白酶的初步研究

论文摘要

酸性蛋白酶可在酸性条件下降解蛋白质，由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，因此，被广泛用于食品、医疗工业及畜牧业生产中。目前，酸性蛋白酶主要通过微生物发酵来生产的。而工业上，酸性蛋白酶的生产菌只有黑曲霉、宇佐美曲霉和米曲霉等为数不多的菌株，通过筛选新的菌种，可以有效地解决目前行业中存在的酶活低及菌种老化的问题。本研究通过酪蛋白透明圈法从实验室保存的几株菌株中筛选出一株产酸性蛋白酶菌株，命名为RN-11菌株，通过真菌ITS序列分子鉴定，再结合对其形态观鉴定的结果，将RN-11菌株确定为黑根霉（匍枝根霉）。采用固态发酵培养法，通过单因素实验及响应面实验设计，确定了RN-11菌株产酸性蛋白酶最佳固态培养基组分为：250ml三角瓶中，麸皮15g，水10.6ml，蔗糖0.69g，硝酸钠1.0g，磷酸氢二钾0.042g。理论最佳酸性蛋白酶活力为159.51U/g，验证试验得到的实际平均酸性蛋白酶活力为160.16U/g，比初始发酵培养基提高了5.1倍。该菌株在最佳培养基初始pH值为2.5，装瓶量为27g湿基，接种量为1ml，培养时间为60h，培养温度26℃时，产酶量达到最高。分别选择蒸馏水、0.05mol/L（pH3.5）的乳酸缓冲液、0.15mol/L的NaCl溶液、0.03mol/L磷酸缓冲液作为提取溶剂提取酸性蛋白酶。结果表明：用0.05mol/L乳酸缓冲液浸提，酸性蛋白酶提取最完全。还对影响酶提取的主要因素，如提取溶剂pH、提取时间、提取温度、浸提液和固体培养基的比率进行了研究，确立了最适的酶提取工艺。结果表明RN-11酸性蛋白酶在用固体曲重量30倍的0.05mol/L的pH3.0乳酸缓冲液于30℃水浴中浸泡105min提取最完全。通过硫酸铵分级沉淀、透析、SephadexG-75凝胶层析三步提取纯化了RN-11酸性蛋白酶。酶的回收率为24.39%，纯化倍数为41.78。酶学性质测定结果表明，经SDS-PAGE电泳， RN-11酸性蛋白酶的分子量约为70Kda。该酸性蛋白酶最适pH范围为2.03.0，最适反应pH为2.5，在pH值2.04.0之间酶活相对比较稳定；适宜温度为4050℃,其最适反应温度为50℃，在3050℃之间有较好的热稳定性；发现终浓度为5M mol/L Na+、K+、Mn2+、Cu2+、Ca2+对酶活不同程度的激活作用，加入Mn2+时可使酶活提高1.4倍，而Zn2+、Li2+、Fe2+对酶活有不同程度的抑制作用，加入Mg2+对酶活性基本没影响。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 酸性蛋白酶概述
• 1.2 酸性蛋白酶的来源及产生菌
• 1.3 国内外酸性蛋白酶的研究进展
• 1.4 酸性蛋白酶的酶学性质
• 1.4.1 酸性蛋白酶的 pH 适应性
• 1.4.2 酸性蛋白酶的温度适应性
• 1.4.3 酸性蛋白酶的抑制剂
• 1.4.4 金属离子对酸性蛋白酶的影响
• 1.5 酸性蛋白酶的生产
• 1.6 酸性蛋白酶的分离和纯化
• 1.6.1 酸性蛋白酶的提取
• 1.6.2 酸性蛋白酶的纯化
• 1.7 酸性蛋白酶的应用
• 1.7.1 酸性蛋白酶在食品工业中的应用
• 1.7.2 酸性蛋白酶在畜牧业中的应用
• 1.7.3 酸性蛋白酶在医疗方面的应用
• 1.8 研究目的和意义
• 1.9 研究内容及技术路线
• 第二章 酸性蛋白酶生产菌株的筛选和鉴定
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 鉴定菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 PCR 引物
• 2.1.4 主要仪器
• 2.1.5 主要溶液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 产酸性蛋白酶菌株的筛选
• 2.2.2 产酸性蛋白酶菌株的形态观察
• 2.2.3 RN-11 菌株核糖体 rDNAITS 序列测定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 产酸性蛋白酶菌株的筛选
• 2.3.2 酸性蛋白酶菌株 RN-11 的形态观察
• 2.3.3 RN-11 菌株基因组 DNA 检测
• 2.3.4 PCR 获得的 ITS 产物
• 2.3.5 PCR 扩增纯化回收
• 2.3.6 rDNA-ITS 序列分析
• 2.4 讨论
• 第三章 RN-11 菌株产酸性蛋白酶发酵条件的优化研究
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 实验菌株
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 主要仪器
• 3.1.4 主要溶液
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 粗酶液的制备
• 3.2.2 酶活力测定方法
• 3.2.3 最佳培养基优化方法
• 3.2.4 最佳发酵条件优化方法
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 标准曲线的制作
• 3.3.2 培养基单因素分析对 RN-11 产酶的影响
• 3.3.3 培养基优化设计及结果
• 3.3.4 最佳培养基的确定
• 3.3.5 最佳发酵条件优化
• 3.4 讨论
• 第四章 RN-11 菌株酸性蛋白酶提取条件的优化
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 实验菌株
• 4.1.2 培养基
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 酶活测定方法
• 4.2.2 菌种发酵
• 4.2.3 酸性蛋白酶提取条件的优化
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 提取溶剂对酶收率的影响
• 4.3.2 提取溶液 pH 对酶收率的影响
• 4.3.3 提取温度对酶收率的影响
• 4.3.4 浸提倍数对酶收率的影响
• 4.3.5 提取时间对酶收率的影响
• 4.4 讨论
• 第五章 RN-11 菌株酸性蛋白酶的分离纯化及酶学性质的研究
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 出发菌株
• 5.1.2 培养基及培养条件
• 5.1.3 主要仪器
• 5.1.4 主要试剂
• 5.1.5 主要溶液
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 酶活测定方法
• 5.2.2 蛋白质浓度测定方法
• 5.2.3 粗酶液浸提
• 5.2.4 硫酸铵分级沉淀预实验
• 5.2.5 硫酸铵沉淀
• 5.2.6 透析
• 5.2.7 凝胶层析
• 5.2.8 酸性蛋白酶的理化性质
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 蛋白质标准曲线的制作
• 5.3.2 硫酸铵分级沉淀预实验
• 5.3.3 凝胶层析
• 5.3.4 酶学性质的研究
• 5.5 讨论
• 第六章 结论与研究展望
• 6.1 结论
• 6.2 研究展望
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历