鸡脾转移因子的研制、检验规程及其应用

论文摘要

本文就鸡脾转移因子（Transfer Factor，TF）的研制、检验规程的制定以及应用等三个方面进行详细阐述，旨在明确鸡脾TF的理化特性及免疫学特性，结合临床应用效果制定出TF的质量控制标准，为鸡脾TF在临床推广应用提供理论依据。试验比较了5批不同批次鸡脾TF的理化特性及组分的变化情况，并与4批猪脾TF做了比较，结果显示不同批次和不同来源的TFpH值均在6.1-6.7之间，为微黄色或浅黄色液体，鉴别反应中茚三铜反应呈紫色，蛋白质定性试验呈阴性，核苷酸与多肽比值为2.0以上。高效液相凝胶层析结果显示不同批次不同来源的TF均含有相同的三个大组分；不同批次的产品稳定性较好，具有良好的重现性。以分子量为5800的胰岛素标准品作对照，按面积归一化法计算小于胰岛素峰保留时间的峰面积占全部峰面积的百分数，以此判断超过分子量5800的高分子物质所占的比例。结果显示在鸡脾TF中该比例均小于0.03％，猪脾TF中均小于0.2％，均达到分子截流5000的标准，因此可以将小于胰岛素峰保留时间的峰面积作为判定鸡脾组分分子量是否达标的质控标准之一。试验同时检测了TF游离氨基酸和水解氨基酸含量，结果显示TF水解氨基酸和游离氨基酸之间在氨基酸含量和种类上存在较大差异，但不同批次和不同来源的水解氨基酸具有类似的峰形走势，但游离氨基酸则不同批次，不同来源之间存在一定差异，表现在氨基酸种类和含量的差异。由于水解氨基酸样品处理过程中存在小肽被破坏的现象，易造成结果的不准确，因此水解氨基酸不作为质控标准，但可以将游离氨基酸总和作为判定标准。结果显示无论来源或批次的不同，每1mlTF中含游离氨基酸的量均超过2mg。采用Sephadex G-25柱层析的方法分离鸡脾转移因子三个组分，通过环磷酰胺建立小鼠免疫抑制模型，用MTT比色法检测鸡脾TF三个分离组分及TF原液对免疫抑制鼠及正常鼠淋巴细胞转化率的影响。同时比较了不同来源鸡脾和猪脾TF各组分及原液对正常小鼠的淋巴细胞转化率的作用。结果表明TF三种组分及原液均对免疫抑制小鼠的外周血淋巴细胞转化率具有明显的增强作用，表现差异显著（P＜0.01），其中组份Ⅲ的淋巴细胞转化率最佳，组份Ⅰ与组份Ⅱ接近，但均优于原液。而对正常小鼠的外周血淋巴细胞转化率却表现不同的结果，其中组分Ⅰ和原液具有显著的免疫增强作用（p＜0.05），组分Ⅱ作用不显著，组分Ⅲ则起到极其显著的抑制作用（p＜0.01）。而不同来源的猪脾TF各组分及原液对正常小鼠的淋巴细胞表现出与鸡脾一致的免疫活性。不同于人脾TF中组分Ⅰ起免疫抑制、组分Ⅲ起免疫促进作用的报道，有待进一步研究。但无论在免疫抑制小鼠或正常小鼠外周血淋巴细胞转化试验中，TF原液均起到促进作用，建议临床使用原液优于提纯。生产上分别采用超滤法和透析法两种不同工艺生产12批不同批次的鸡脾TF。比较不同工艺、不同保存温度、保存时间对多肽及核糖含量的影响，了解影响产品稳定性因素，确定生产、贮存过程中TF质量控制指标。结果显示超滤法较透析法更好地应用于大规模工业化生产。而透析法由于稳定性差，不适合规模生产，采用透析法应考虑流速对多肽和核糖含量的影响，将最佳流速控制在70ml／min。随着保存时间的延长，多肽及核糖含量会下降，TF最佳贮存温度4℃优于-20℃，建议保存时间不应超过12个月。动物免疫效果试验比较了单独使用鸡脾TF与疫苗联合使用，在不同剂量、不同使用时间的情况下对肉鸡增重、死淘率、淋巴细胞比率、免疫器官指数、巨噬细胞吞噬指数的影响。结果表明，临床使用的鸡脾TF多肽含量应控制在1mg／ml（而生产的TF多肽含量应超过该指标）。当鸡群处于健康状态时TF对日增重、死淘数影响不大，而处于亚健康状态鸡群使用0.5ml，多肽含量为1mg／ml的TF可以明显提高鸡群日增重、降低死淘率，与疫苗组效果相当，甚至提高日增重和提高巨噬细胞吞噬指数方面优于疫苗组。试验还发现疫苗对机体具有好的免疫保护作用和促长作用。而疫苗加TF组和疫苗组相比虽然差异不显著，但某些指标上优于疫苗组。临床建议处于亚健康状态的家禽使用鸡脾TF以提高机体抗病力，可与疫苗免疫同时使用，临床饮水使用的最佳剂量为0.5ml。试验比较了TF在万只商品肉鸡场的临床预防效果试验，结果显示TF具有提高鸡只增重，降低死亡率和延迟鸡只发病时间的作用。同时比较了TF在标准试验场及普通用户养殖场的预防及治疗效果试验（部分摘录15个试验报告），试验涉及肉鸡、蛋鸡、杂交鸡和肉鸭。结果表明TF具有较好的防病效果和改善生产性能的作用，临床将TF与其它抗生素或化药配合使用具有较好的治病效果，与常规药物治疗相比，具有治愈率快，缩短疗程的作用。试验同时比较了TF与抗病毒中药配伍使用临床预防效果，分别比较了肉小鸡阶段（0-21日龄），肉中级阶段（22-35日龄）和肉大鸡阶段（36-42日龄）及1-42日龄的鸡只体重变化、料重比及育肥指数的变化情况，结果发现TF与抗病毒中药联合使用时肉鸡的生产性能不如单独使用TF，由于试验中未发生病毒病，因此二者联合使用治疗疾病方面是否具有协同作用有待进一步研究，建议临床合理将TF与其它抗病毒中药配伍使用，在考虑防治疾病的同时也应关注生产性能的改善。本文综合鸡脾TF理化特性指标、免疫学指标和临床应用指标，参照人用TF的标准，最终制定出鸡脾TF口服液的制造及检验规程（草案）作为鸡脾TF质控标准，为鸡脾TF在兽医临床推广应用提供切实可行的理论依据。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 第一部分 文献综述
• 第二部分 实验部分
• 第一章 不同来源脾转移因子组分测定及理化特性的研究
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 TF制备
• 1.2 TF理化特性检测
• 1.2.1 外观检测
• 1.2.2 pH值检测
• 1.2.3 蛋白质反应
• 1.2.4 鉴别反应
• 1.2.5 多肽含量检测
• 1.2.6 核糖含量检测
• 1.2.7 核苷酸与多肽比值（OD260/280）检测
• 1.2.8 无菌检测
• 1.2.9 动物安全试验
• 1.3 TF分子量及组分的检测
• 1.3.1 高效液相凝胶层析色谱条件
• 1.3.2 对照品溶液的制备
• 1.3.3 供试样品溶液的制备
• 1.3.4 进样检测
• 1.4 TF氨基酸检测
• 1.4.1 氨基酸分析仪色谱条件
• 1.4.2 氨基酸对照品及待测样品制备
• 1.4.3 进样检测
• 2 结果
• 2.1 理化特性检测结果
• 2.1.1 外观性状
• 2.1.2 PH值
• 2.1.3 鉴别试验
• 2.1.4 蛋白质定性
• 2.1.5 核苷酸与多肽比值
• 2.1.6 无菌检验
• 2.1.7 动物安全性试验
• 2.1.8 多肽及核糖含量检测结果
• 2.2 高效液相色谱检测结果
• 2.2.1 鸡脾TF的高效液相色谱检测结果
• 2.2.2 猪脾TF的高效液相色谱检测结果
• 2.3 TF水解氨基酸及游离氨基酸组成及含量
• 2.3.1 鸡脾TF的水解氨基酸组成及含量
• 2.3.2 鸡脾TF的游离氨基酸组成及含量
• 2.3.3 猪脾TF的水解氨基酸组成及含量
• 2.3.4 猪脾TF的游离氨基酸组成及含量
• 3 讨论
• 参考文献
• 第二章 鸡脾转移因子活性组分的提取及免疫活性的研究
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 主要仪器设备
• 1.2 材料
• 1.3 TF Sephadex G-25柱层析分离
• 1.4 MTT法检测TF免疫活性
• 1.4.1 小鼠免疫抑制模型的建立
• 1.4.2 MTT比色法检测鸡脾TF分离组分及原液的免疫活性
• 1.4.2.1 免疫抑制组
• 1.4.2.2 正常鼠淋巴细胞组
• 2 结果
• 2.1 不同批次不同来源TF的Sephadex G-25柱层析分离提取
• 2.2 小鼠免疫抑制模型的成功建立
• 2.3 鸡脾TF各组分提取液及原液对免疫抑制型鼠外周血淋巴细胞转化率作用
• 2.4 鸡脾及猪脾来源TF各组分提取液及原液对正常鼠外周血淋巴细胞转化率作用
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三章 鸡脾转移因子对肉鸡免疫应答及防病效果的研究
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 TF
• 1.2 试验分组
• 1.3 试验检测指标
• 1.3.1 TF对肉鸡平均体重及日增重的影响
• 1.3.2 TF对肉鸡死亡率的影响
• 1.3.3 TF对淋巴细胞比率的影响
• 1.3.4 TF对肉鸡免疫器官指数和巨噬细胞吞噬功能的影响
• 2 结果
• 2.1 TF对肉鸡平均体重及日增重的影响
• 2.2 TF对肉鸡死亡率的影响
• 2.3 TF对肉鸡血液淋巴细胞比率的影响
• 2.4 TF对肉鸡免疫器官指数的影响
• 2.5 TF对肉鸡巨噬细胞吞噬指数的影响
• 3 讨论
• 参考文献
• 第四章 鸡脾转移因子生产工艺的筛选及保存条件的确定
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 主要仪器设备
• 1.2 TF制备方法
• 1.2.1 超滤法
• 1.2.2 透析法
• 1.2.3 比较超滤法和透析法两种工艺对多肽和核糖含量的影响
• 1.3 稳定性试验
• 1.3.1 比较不同温度不同保存时间多肽和核糖含量的变化
• 1.3.2 比较透析法不同流速对多肽和核糖含量的影响
• 2 结果
• 2.1 生产工艺流程
• 2.2 不同制备工艺的鸡脾TF多肽及核糖含量
• 2.3 比较超滤法和透析法两种工艺多肽和核糖含量
• 2.4 稳定性试验
• 2.4.1 透析法不同流速对多肽及核糖含量的影响
• 2.4.2 -20℃不同保存时间TF多肽及核糖含量的变化
• 2.4.3 不同保存温度多肽及核糖含量的变化
• 3 讨论
• 参考文献
• 第五章 鸡脾转移因子临床应用效果研究
• 第一节 鸡脾转移因子在万只商品肉鸡场临床应用效果研究
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 TF
• 1.2 试验地点
• 1.3 试验分组
• 1.4 试验记录
• 2 结果
• 2.1 鸡舍环境对比
• 2.2 体重对比
• 2.3 饮水量变化
• 2.4 死淘数对比
• 3 讨论
• 参考文献
• 第二节 鸡脾TF与抗病毒中药配伍使用的肉鸡效果试验
• 摘要
• 1 材料
• 1.1 TF
• 1.2 抗病毒中药制剂
• 1.3 试验动物
• 1.4 肉鸡饲料
• 2 方法
• 2.1 试验分组
• 2.2 试验处理
• 2.3 试验记录
• 3 结果与分析
• 3.1 肉小鸡阶段生产性能比较
• 3.2 肉中鸡阶段生产性能比较
• 3.3 肉大鸡阶段生产性能比较
• 3.4 1-42日龄各组生产性能结果与分析
• 4 讨论
• 参考文献
• 第三节 鸡脾转移因子临床应用报告（部分摘录）
• 一、TF在平度肉鸡户临床治疗效果试验
• 二、TF在六和技术部试验鸭场临床预防效果试验
• 三、TF在稻田养殖户鸭场临床预防效果试验
• 四、TF在高密养殖户肉鸡场临床治疗效果试验
• 五、TF在寿光养殖户鸭场临床治疗效果试验
• 六、TF在昌乐养殖户肉鸡场临床治疗效果试验
• 七、TF在济南养殖户蛋鸡场临床治疗效果试验
• 八、TF在济南养殖户肉鸡场临床治疗效果试验
• 九、TF在济南涧沟村养殖户蛋鸡场临床治疗效果试验
• 十、TF在阳谷县养殖户杂交肉鸡场临床预防效果试验
• 十一、TF在莱州养殖户肉鸡场临床预防效果试验
• 十二、TF在河北沧州养殖户肉鸡场预防使用效果试验
• 十三、TF在河北沧州养殖户肉鸡场治疗使用效果试验
• 十四、TF在辽宁抚顺养殖户肉鸡场预防使用效果试验
• 十五、TF在辽宁锦州养殖户肉鸡场治疗使用效果试验
• 鸡脾转移因子口服液的制造及检验规程（草案）
• 附录1 鸡脾TF口服液体外活性的测定
• 附录2 高效液相色谱法检测高分子量物质及组分
• 编制说明
• 附录3
• 多肽含量测定方法
• 核糖含量测定方法
• 生产用水来源及质量标准
• 附图表
• 图1-15至1-32 鸡猪TF水解氨基酸、游离氨基酸图谱
• 图1-33 氨基酸标准品图谱
• 图4-7至4-10，表4-7至4-8 鸡脾 TF不同温度保存多肽与核糖含量检测结果
• 结论
• 参考文献（文献综述部分）
• 致谢