论文摘要
研究背景:创伤、骨性关节炎等疾病引起的软骨病变或骨软骨联合病变是骨科较为常见的疾患,同时由于关节软骨自我修复能力有限,目前的多种治疗方法,如微骨折术、自体或异体组织（骨膜、软骨膜、骨软骨块）移植等,存在种种缺陷从而限制了其临床应用,并且不能获得满意的治疗效果。应用组织工程技术构建组织工程软骨或骨软骨复合体被认为是目前最有可能解决此难题的技术手段。组织工程包括三大因素:种子细胞、支架材料和信号因子。骨髓基质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）具有多向分化潜能,已经被证实能够向骨、软骨等多种组织分化;由于经过脱细胞处理去除了细胞抗原等免疫性物质而保留了大部分细胞外基质,来源于天然细胞外基质的支架材料,如人脱细胞真皮、脱细胞猪小肠黏膜下层、脱细胞猪心瓣膜以及脱细胞猪膀胱等,已经获准临床应用,目前虽然有关软骨脱细胞处理的文献报道,但研究水平仅停留在整块脱细胞或者粉碎成软骨微粒脱细胞的层面上,未见利用天然软骨细胞外基质成功构建出三维多孔网状支架的报道。本研究的目的是以天然软骨细胞外基质材料为基础,研制组织工程软骨支架、组织工程骨软骨双层（双相）支架,并探讨其与骨髓基质干细胞复合构建组织工程软骨以及骨软骨复合体的可行性。在内容上主要包括:（1）利用软骨细胞外基质材料制备软骨组织工程用支架材料,并复合骨髓基质干细胞在体外以及裸鼠皮下异位构建组织工程软骨;（2）利用软骨细胞外基质和脱细胞骨基质制备组织工程用骨软骨双层（双相）支架,并在体外构建组织工程骨软骨复合体;（3）利用骨髓基质干细胞复合骨软骨双层支架修复犬膝关节负重区骨软骨联合缺损,并对其结果进行大体、组织学、生物化学、生物力学、Micro-CT评估。方法:（1）将天然人软骨粉碎,取500nm～5μm软骨微丝,经脱细胞处理后制备为软骨细胞外基质微丝悬液,冷冻冻干法制备得三维多孔支架,采用物理/化学方法交联,得到软骨细胞外基质来源的三维多孔支架（CartilageECM-derived 3-D Porous Scaffold,CEDPS）,对支架材料进行组织学、生化成分定量分析以及理化性能检测。分离培养犬骨髓基质干细胞,评价支架生物相容性和细胞毒性。（2）将软骨细胞外基质微丝与壳聚糖复合,构建出三维多孔组织工程支架,并对其理化性能进行评估。（3）骨髓基质干细胞经含10ng/ml TGF-β1,10ng/ml bFGF,10-7M地塞米松的条件培养基成软骨诱导后,种植到CEDPS支架上,扫描电镜观察细胞黏附情况,Dead/Live免疫荧光染色观察支架内部细胞活性,体外培养1,3周后观察大体形态和组织学形态变化,同时行Ⅱ型胶原免疫组织化学分析。（4）BMSCs成软骨诱导后,用PKH26荧光染料标记,构建BMSCs-CEDPS支架复合体,体外培养3d后,植入裸鼠背部皮下,利用分子荧光活体成像系统无创伤性评估组织工程化组织在裸鼠体内生长情况,4周后取材,进行组织学检测以及Ⅱ型胶原免疫组织化学与免疫荧光分析。（5）用新型脱细胞方法制备脱细胞骨基质（AcellularBone Matrix,ACBM）,评估其理化特性与生物相容性。（6）分别用软骨细胞外基质与脱细胞骨以及PLGA与脱细胞骨构建两种组织工程骨软骨双层支架:CEDPS/ACBM,PLGA/ACBM,评估其理化性能。（7）利用BMSCs与CEDPS/ACBM双层支架体外构建组织工程骨软骨复合体,并进行大体、电镜、组织学观察。（8）在犬膝关节内外髁高负重区造一直径4.2mm,深6mm的骨软骨缺损,分为诱导BMSCs-CEDPS组（实验组）和单纯CEDPS支架组（对照组）,分别在3,6月取材,从大体,组织学,生物化学及生物力学,Micro-CT等方面进行全面评估。结果:（1）组织学显示CEDPS支架中无软骨细胞碎片残留,,甲苯胺蓝染色、蕃红花“0”、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈阳性;生化定量结果表明支架保留了大部分的细胞外基质成分;Micro-CT与扫描电镜结果显示支架内孔洞相互连通似海绵状,具有良好的孔径和孔隙率;理化性能结果显示支架具有良好的吸水性能,支架的纵向弹性模量与软骨一个数量级,并且具有良好的拉伸性能。倒置显微镜、扫描电镜观察显示细胞在支架上生长良好,细胞毒性实验表明支架对细胞的生长、增殖无影响。（2）软骨细胞外基质与壳聚糖复合支架具有良好的孔径、孔隙率和吸水性,生物力学结果表明复合支架的弹性模量与软骨同一数量级。（3）体外培养的BMSCs-CEDPS复合体形成了类软骨样组织,Dead/Live染色表明支架内部均为活细胞,组织学结果表明蕃红花“0”、Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,电镜和组织学结果表明随着培养时间的增加,细胞在支架中增殖显著,细胞外有大量基质分泌。（4）经诱导的BMSCs与CEDPS支架在裸鼠皮下成功构建了类软骨组织,PKH26荧光示踪以及分子荧光活体成像系统能无创伤评估组织工程化软骨在裸鼠体内的生长情况,结果表明构建的类软骨组织中的细胞来源于接种的BMSCs。（5）新方法制备的脱细胞骨基质材料去细胞彻底,具备良好的微观结构,与同部位的新鲜骨块具有相似的生物力学性能。（6）制备的两种组织工程骨软骨双层（双相）支架:CEDPS/ACBM,PLGA/ACBM,均具有良好的孔径和孔隙率,并且支架的骨、软骨部分结合良好。（7）体外培养的BMSCs与CEDPS/ACBM双层支架复合体,组织学结果表明软骨部分蕃红花“0”、Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,骨软骨层结合良好。（8）在修复犬膝关节骨软骨缺损的实验中,结果显示两组以纤维软骨或透明软骨对缺损有不同的修复,大体以及组织学评分表明实验组明显优于对照组,生物力学测试表明6月实验组修复软骨的刚度为正常膝关节软骨的70.1%,与生物化学分析结果一致;软骨下骨的刚度达到正常膝关节的74.96%。Micro-CT结果表明实验组与对照组软骨下骨重建不具备明显差异。结论:（1）以天然软骨细胞外基质为材料构建的三维多孔海绵支架,去细胞彻底,保留了软骨细胞外基质的主要成分,具备合适的孔径、孔隙率、吸水性能、生物力学性能以及良好的生物相容性,无细胞毒性,可作为软骨组织工程的支架载体。（2）软骨细胞外基质与壳聚糖复合支架具有良好的孔径、孔隙率、吸水性、生物力学性能,可作为软骨组织工程支架载体的良好选择。（3）CEDPS能为BMSCs成软骨方向诱导分化提供理想的三维立体环境,BMSCs与CEDPS复合能在体外构建类软骨样组织。（4）PKH26荧光示踪与分子荧光活体成像系统结合,能够无创伤性评估组织工程化组织的种子细胞在动物体内生长情况与转归。（5）利用BMSCs和CEDPS支架能够在裸鼠皮下异位构建类软骨样组织。（6）新方法制备的脱细胞骨基质材料去细胞彻底,具备良好的微观结构,合适的生物力学性能,可作为骨组织工程支架载体的良好选择。（7）制备的两种组织工程骨软骨双层支架:CEDPS/ACBM,PLGA/ACBM,两层结构分别适合骨、软骨生长的不同要求,并且层间结合紧密,可作为构建组织工程骨软骨复合体的支架载体的良好选择。（8）成软骨诱导的BMSCs与CEDPS/ACBM双层支架复合在体外能培养出骨软骨样组织。（9）CEDPS/ACBM双层支架复合成软骨诱导的BMSCs能成功修复犬膝关节负重区骨软骨联合缺损。
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