南药青天葵的抗急性肺损伤作用机理及其质量标准研究

论文摘要

青天葵首载于《陆川本草》,为兰科植物毛唇芋兰Nervilia fordii（Hance）Schitr.的全草或叶,是广东、广西有名的中草药,其性凉味甘,具有清热、润肺、散瘀、解毒的功效,常用于治疗肺痨、痰火咳血、瘰疬、肿毒和跌打损伤等,临床广泛用于肺炎、支气管炎、急性喉炎、小儿疳积、疮毒等症,疗效确切。青天葵在两广、港澳及东南亚等地较常用,出口量较大,药材市场价格昂贵。作为南方民间用药,其在临床上的应用越来越多,已经广泛被临床医师认可。但其资源分布有限,繁殖系数极低,加之乱采乱挖,野生青天葵资源日益枯竭。青天葵目前还未有系统的研究,未有法定的的质量标准,因而难以有效的监督和规范市场。故对青天葵进行有效部位筛选、成分及其质量方面的研究,通过制定质量标准规范市场并促进青天葵的合理开发综合利用。青天葵在临床应用中表现出较好的清热解毒作用。全身炎症反应综合征（SIRS）可由致病微生物代谢产生的毒素引发,严重感染所致的内毒素症与中医的热毒证相似。因此,采用内毒素（LPS）致大鼠急性肺损伤（ALI）模型,考察青天葵对大鼠ALI的影响,并探讨青天葵对抗SIRS-ALI的炎症机制。方法:1.采用大孔树脂、聚酰氨树脂、离子交换树脂等柱层析方法富集各提取部位,经真空浓缩、减压干燥、冷冻干燥、喷雾干燥等方法制备青天葵活性提取物,以HPLC等方法进行分析检测;2.以青天葵及其各提取物为研究对象,采用抗炎镇痛药理动物模型试验（小鼠耳肿胀等）、解热模型（酵母致大鼠发热）、镇咳模型（小鼠氨水引咳、豚鼠引喘）、增强免疫药效模型等进行实验,筛选确定青天葵药效作用的活性部位。3.采用内毒素致大鼠急性肺损伤模型,以清开灵注射液或参麦注射液为阳性对照,考察青天葵及其有效部位对急性肺损伤大鼠的保护作用,并探讨青天葵抗炎作用的机理。4.结合青天葵药理实验结果,针对有效部位,采用现代色谱技术进行化学成分的单体分离,以质谱、紫外光谱、红外光谱、核磁共振谱来解析其化学结构。5.参照中国药典附录相关实验方法,测定青天葵药材的水分、水溶性浸出物、醇溶性浸出物等指标,并采用TLC法鉴别青天葵中氨基酸、黄酮类成分,采用HPLC法测定青天葵药材中黄酮类成分的含量。结果:1.采用大孔树脂结合聚酰氨树脂等技术富集制备青天葵总黄酮,总黄酮得率约为1%,对产品进行紫外光谱扫描检测,结果显示其在210nm、260nm、350nm左右分别有较强的吸收;采用离子交换树脂结合脱色工艺富集制备青天葵总氨基酸,总氨基酸得率约为4%,产品进行氨基酸自动分析仪检测,结果显示产物含有除色氨酸外的其他7种人体“必需氨基酸”,还含有组氨酸、精氨酸等多种人体合成速度不能满足身体需要的氨基酸,和其他“非必需氨基酸”。2.抗炎动物实验结果显示,青天葵及其各提取物能减轻二甲苯致炎小鼠的耳肿胀率（p＜0.05或p＜0.01）、抑制醋酸所致小鼠毛细血管通透性增高（p＜0.05或p＜0.01）、抑制角叉菜胶引起大鼠足跖肿胀（p＜0.05或p＜0.01）、对大鼠棉球肉芽组织有较好的抑制作用（p＜0.05或p＜0.01）,提示青天葵及其各提取物有较好的抗炎作用;镇痛动物实验结果显示,各实验组均能显著减少醋酸所致小鼠扭体次数（p＜0.01）,减少甲醛足跖皮下注射所致疼痛小鼠的舔足累积时间（p＜0.05或p＜0.01）,提示青天葵及其提取物具有较好的镇痛作用;增强免疫动物实验结果显示,青天葵及其各提取物显著提高小鼠的廓清指数（p＜0.01）,并提高小鼠免疫器官胸腺、脾脏的重量系数（p＜0.05）,提示青天葵有调节免疫功能的作用;解热动物实验结果显示,各受试药均能显著降低大鼠酵母致热后的体温（p＜0.05,p＜0.01）,提示青天葵及其各提取物有较好的解热作用;止咳平喘动物实验结果显示,青天葵及其各提取物均可显著延长小鼠咳嗽潜伏期p＜0.01,p＜0.05),且有一定的抑制小鼠咳嗽的效果（p＜0.05）,同时,各受试药均能不同程度延长氯化乙酰胆碱和组胺所致的豚鼠呼吸困难潜伏期（p＜0.01,p＜0.05）,提示青天葵具有止咳平喘的功效。另外,析因方差分析结果显示,青天葵总黄酮和总氨基酸对于抑制二甲苯致小鼠耳肿胀、抑制角叉菜胶引起的大鼠足跖肿胀、减少醋酸所致小鼠扭体次数、提高小鼠的廓清指数、降低啤酒酵母致大鼠体温升高作用、延长小鼠咳嗽潜伏期等有协同增效的作用。3.以脂多糖内毒素（LPS）静脉注射致大鼠急性肺损伤,青天葵及其提取物预防给药,结果显示:青天葵水提物组平均动脉压4h降低率显著低于模型组（p＜0.05）;动脉血气分析显示,青天葵各受试药组大鼠较模型组二氧化碳分压显著下降（p＜0.01）,血氧饱和度、氧合血红蛋白也有显著的上升（p＜0.01,p＜0.05）,提示青天葵可有效抑制急性肺损伤引起的缺氧性血压下降;青天葵各受试药组与模型组比较,促炎症因子TNF-α、IL-6水平显著下降（p＜0.01）,而抗炎因子IL-10水平上升;病理切片结果显示,青天葵给药可避免注射内毒素引起的肺泡壁增厚、泡腔变小、炎症介质渗出等肺损伤症状;扫描电镜可见青天葵给药组动物轻度肺损伤,肺泡腔结构基本完整,泡壁无破损,泡腔内无分泌物,无血栓和胶原纤维,损伤程度远轻于模型组;透射电镜可见肺泡腔内有少量分泌物渗出,内皮细胞、基底膜等结构正常,损伤程度轻于模型组,为轻度损伤;与模型组比较,青天葵受试药组大鼠肺血管通透性指数显著下降（p＜0.01）,肺湿/干重比值明显下降（p＜0.01）。4.采用逆流萃取色谱（HSCCC）从青天葵总黄酮中分离得到两个黄酮苷类成分,经光谱鉴定,分别是:鼠李秦素-3-O-β-D-葡萄糖苷和鼠李秦素-3,4’-二-0-β-D-葡萄糖苷。5.对多批青天葵药材进行水分测定以及水溶性、醇溶性浸出物的测定,结果青天葵药材水分含量在6.82%～11.06%之间,暂定水分含量不得超过12.0%;水溶性浸出物含量在20.45%～30.55%之间,暂定水溶性浸出物含量不得少于20.0%;95%乙醇浸出物含量在4.66%～5.74%之间,暂定95%乙醇溶性浸出物含量不得少于4.0%。6.以正丁醇-冰醋酸-水（4:1:1）为展开剂,5%茚三酮乙醇液为显色剂,鉴别出青天葵的亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸;以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水-甲醇（5:3:0.6:0.5:0.8）为展开剂,喷以5%三氯化铝溶液,在366nm紫外灯下检视,鉴别出青天葵的鼠李秦素-3-O-β-D-葡萄糖苷和鼠李秦素-3,4’-二-0-β-D-葡萄糖苷斑点。7.采用HPLC法建立青天葵中鼠李秦素-3-O-β-D-葡萄糖苷和鼠李秦素-3,4’-二-0-β-D-葡萄糖苷的含量测定方法,其色谱条件如下:Kromasil C18柱,（5μm,250mm×4.60mm）;流动相:甲醇—水梯度洗脱（0min-5min,甲醇浓度保持40%,15min递升至50%,25min递升至52%;35min递升至55%,37min递升至90%,保持5min）;流速:1mL·min-1;检测波长:266nm;柱温:35℃。经方法学论证,两个黄酮苷化合物分别在0.112～2.800μg、0.098～2.450μg范围内,线性关系良好,r＞0.999;样品精密度和稳定性良好,RSD＜2.0%;加样回收率在96%～102%之间。该方法成功用于青天葵药材的含量测定,对多批青天葵进行含量测定,结果青天葵药材中这两个黄酮苷含量的总量在0.36mg/g～0.52 mg/g之间,暂定青天葵药材黄酮含量限度为:按干燥品计,每克药材含鼠李秦素-3-O-β-D-葡萄糖苷和鼠李秦素-3,4’-二-0-β-D-葡萄糖苷的总量不得少于0.3mg。8.综合实验结果5、6、7,初步制定了青天葵的药材质量标准草案。结论:1.氨基酸类、黄酮类成分是青天葵药材中的有效部位,本研究中所采用的制备方法简便,产品纯度高、产量大,可为青天葵的制剂工艺提供参考。2.药效学研究结果显示青天葵具有良好的抗炎、镇痛、增强免疫、解热、止咳平喘的作用,为青天葵临床治疗外感风热所致的肺炎、支气管炎、咽喉肿痛、咳喘、发热等症提供了药理学实验依据;同时,还确定了青天葵总黄酮和总氨基酸在上述药理实验中的作用,实验表明两者在发挥某些药效作用时有协同增效的作用。3.青天葵及其总氨基酸和总黄酮的混合物对急性肺损伤大鼠有保护作用。青天葵给药可有效抑制急性肺损伤模型平均动脉压的降低,维持一定的动脉压力;动脉血气分析结果显示,青天葵可增加血氧分压,降低二氧化碳分压,同时增加血氧饱和度和氧合血红蛋白量,升高血酸碱度,从而有效减轻内毒素造成的缺氧引起的血压下降、代谢性酸中毒所致的体内酸碱平衡紊乱;可减轻肺损伤所致的肺血管通透性增加,减轻急性肺损伤炎症,抑制血管炎症介质的渗出;减轻急性肺损伤引起的肺水肿症状;降低引起急性肺损伤的促炎症因子TNF-α、IL-6、ICAM-1的水平,抑制促炎症因子的释放,增加抗炎因子IL-10水平,从而抑制炎症反应;具有抗氧自由基、改善微循环等作用。另外,青天葵总黄酮与总氨基酸有效部位的混合物也具有抗急性肺损伤的作用,提示可将该有效部位开发成新药,造福急性肺损伤的危重病人。4.从青天葵有效部位中分离得到黄酮类化合物单体,并采用HPLC进行相关含量测定,结合氨基酸和黄酮的TLC鉴别及相关检查项目的检测,初步制定质量标准草案,基本能反映药材本质特征,保证药材的“有效、稳定、可控”,本质量标准可用于药材规范市场,为促进青天葵的合理开发综合利用提供基础。本研究的创新之处:1.从青天葵药材中分离得到两个黄酮苷类化合物,均为首次从青天葵中分离得到。并以分离得到的两个黄酮苷成分对青天葵药材进行TLC鉴别和HPLC含量测定。2.对青天葵及其有效部位总氨基酸、总黄酮进行抗炎、镇痛、增强免疫、解热、止咳平喘等动物实验研究。结果表明两者均有较好的药效作用,部分实验还有协同增效的作用。本研究为首次将青天葵及其氨基酸、黄酮部位进行抗炎、解热等动物实验筛选研究。首次将青天葵及其混合有效部位进行急性肺损伤大鼠模型实验,并初步探讨其抗炎的作用机理。3.进行药材质量标准研究,结合TLC鉴别、HPLC含量测定以及相关检查项目结果,初步建立了青天葵药材的质量标准。4.体现了“选择疗效确切的中药为研究对象,以在体动物试验模型筛选评价药理作用,基于药效作用跟踪的有效成分单体分离,以先进可靠的分析检测方法监控质量”这一科研思路,为最终揭示青天葵抗炎作用及其物质基础,建立药材质量的科学评价方法,实现药材可持续开发利用及中药新药开发提供了科学依据。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 引言
• 第一章 文献研究
• 第一节 青天葵文献研究
• 一、本草考证及资源
• 二、鉴别研究
• 三、化学成分
• 四、药理作用
• 五、质量标准
• 六、临床应用
• 第二节 急性肺损伤文献研究
• 一、急性肺损伤发病机制研究进展
• 二、急性肺损伤动物模型研究
• 三、中医药抗急性肺损伤作用机理研究进展
• 第二章 青天葵主要药效学研究及有效部位的确定
• 第一节 青天葵有效部位的制备
• 第二节 青天葵主要药效学研究及有效部位的确定
• 一、青天葵抗炎作用研究
• 二、青天葵镇痛作用研究
• 三、青天葵调节免疫作用研究
• 四、青天葵解热作用研究
• 五、青天葵镇咳平喘作用研究
• 六、小结
• 第三章 青天葵抗急性肺损伤作用及其机制研究
• 1. 实验材料
• 2. 实验方法
• 3. 统计处理
• 4. 实验结果
• 5. 讨论
• 第四章 青天葵的质量标准研究
• 第一节 青天葵黄酮类单体成分的研究
• 第二节 青天葵质量标准的研究
• 一、各检查项目的测定
• 二、薄层鉴别
• 三、含量测定
• 四、药材质量标准草案及起草说明
• 第五章 结语
• 一、结论
• 二、讨论
• 三、创新之处
• 四、展望
• 参考文献
• 附录
• 一、组织病理切片图
• 二、组织电镜图
• 三、化合物光谱检测图
• 研究生在学期间发表论文情况
• 致谢