Rho激酶信号通路在Endothelin-1诱导的人气道平滑肌细胞迁移和细胞骨架变化中的作用

论文摘要

研究背景及目的支气管哮喘（Bronchial asthma,asthma）是一种气道慢性炎症性、过敏性疾病,气道重塑（Airway remodeling）是慢性支气管哮喘重要病理学特征,主要表现为气道基底膜增厚和上皮下纤维化、气道平滑肌的肥厚、增殖、细胞外基质蛋白的沉积,炎性细胞浸润和腺体增生肥大等等。而作为气道中数目和体积最大的细胞:气道平滑肌细胞（Airway smooth muscle cell,ASMC）,在哮喘气道重塑中发挥重要的作用,被认为是哮喘气道重塑的关键细胞。ASMC的收缩、增殖、肥大、分泌细胞外基质蛋白等促进气道重塑的发生发展,并进一步加重气道高反应性（Airway Hyperreactivity,AHR）。近年来有研究发现,ASMC也具有迁移的功能,这种迁移与动脉粥样硬化时血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cell,VSMC）的迁移相类似,因此可以推测:哮喘时ASMC在细胞外基质的影响和各种细胞因子、炎症介质和生长因子的联合作用下,ASMC向气道内膜定向移动并发生增殖,导致气道壁的增厚和狭窄,虽然目前还缺乏ASMC向气道内膜直接迁移的证据,但有研究发现,在哮喘患者气道活检组织标本中,气道固有层内发现的肌纤维母细胞在显微结构、形态学和位置方面都与ASMC极其相似,提示肌纤维母细胞可能是ASMC迁移并转化而来,ASMC的迁移的研究是近来的热点之一,但对于ASMC迁移的机制目前还不十分清楚。目前已经发现,细胞因子和炎症介质包括PDGF、IL-1β、尿激酶、半胱氨酸白三烯、LPA等能够趋化ASMC的迁移,而作为哮喘时气道内一种重要的炎症介质,内皮素-1（Endothelin-1,ET-1）是目前已知的收缩支气管最强烈的物质之一,哮喘时气道上皮损伤后表达增多,已经发现它能诱导许多类型的细胞例如嗜酸性粒细胞（EOS）、血管平滑肌细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、表皮黑素细胞等迁移,但ET-1能否诱导ASMC的趋化迁移,目前还缺乏相关研究。Rho/Rho激酶信号通路是细胞内重要的信号通路,Rho激酶（ROCK）是该通路的关键分子,越来越多的证据表明该通路参与了哮喘时气道高反应性（AHR）的形成、EOS向BALF聚集、气道重塑等多种病理生理过程,但该通路在ASMC迁移中报道甚少。因此,本实验主要对以下两个方面进行研究:一)研究ET-1对ASMC的诱导迁移作用。二)初步探讨Rho激酶信号通路在ASMC迁移中的作用。材料与方法1、经患者同意,取南方医院胸外科同期做肺叶切除术患者的正常肺叶、段支气管标本。2、组织块贴壁法培养人支气管平滑肌细胞（Airway smooth muscle cell,ASMC）,光镜下观察和细胞免疫组化进行ASMC鉴定。3、使用改良的boyden chamber小室检测不同浓度ET-1作用下ASMC的跨膜迁移能力的变化,5ng/ml的PDGF作为阳性对照。4、不同浓度的Rho激酶特异抑制剂Y-27632阻断Rho激酶信号通路,观察该信号通路在ET-1诱导的ASMC迁移中的作用。5、FITC标记的鬼笔环肽标记F-肌动蛋白骨架,激光共聚焦扫描显微镜观察ASMC细胞骨架的变化。6、Western blot检测ET-1作用不同时间Rho激酶信号通路下游底物肌球蛋白磷酸酶目标亚单位1（myosin-phosphatase target 1,MYPT1）的磷酸化水平,以反应Rho激酶信号通路的活化状况。7、采用SPSS13.0统计软件进行结果分析,统计数据用均数±标准差（（?）±S）表示,组间比较用one-way ANOVA分析,P＜0.05为差异有统计学意义。结果1、ASMC的形态及免疫组化鉴定:倒置显微镜下单个ASMC呈长梭形,贴壁生长至融合后,细胞呈现出特征的“峰谷”状形态。细胞免疫组化平滑肌细胞表型标志物a-actin鉴定,光镜下可见细胞浆中较多棕黄色颗粒为染色阳性细胞。2、ET-1在0.1、1、10、100nmol/L浓度有诱导ASMC跨膜迁移的作用,迁移细胞数目分别为（25.2±1.56）、（36.03±2.94）、（49.80±4.47）、（37.96±3.59）个,ET-1浓度在10nmol/L趋化ASMC跨膜迁移能力最强,与对照组（19.08±2.06）个相比,二者差异有统计学意义（P＜0.01）。5ng/ml的PDGF能显著诱导ASMC迁移（87.73±6.14）个,与对照组（19.08±2.06）相比,差异有统计学意义（P＜0.01）。3、Rho激酶抑制剂Y-27632呈浓度依赖性抑制ET-1（10nmol/L）诱导的ASMC跨膜迁移,且随着其浓度的增加,抑制作用越明显,Y-27632浓度为0.4μmol/L、2μmol/L、10μmol/L时迁移细胞数目分别为（44.26±2.50）、（34.56±1.67）、（20.93±1.84）个,其中Y-27632浓度10μmol/L时显著抑制ASMC的跨膜迁移,与Y27632（0μmol/L）组（48.30±2.64）个相比,差异有统计学意义（P＜0.01）。4、激光共聚焦观察细胞骨架:空白对照组细胞有少量短而细的应力纤维,无丝状伪足形成。ET-1（10nmol/L）刺激30min细胞即发生伸展,应力纤维形成增多;加入Rho激酶特异抑制剂Y-27632（10μmol/L）预处理后,细胞轮廓变细,伪足及应力纤维少见。5、western blot:ET-1（10nmol/L）处理15min、30min、1h、2h、6h、12h、24h后,磷酸化MYPT1（p-MYPT1）蛋白的相对表达量分别为:0.68±0.04、0.66±0.10、0.44±0.06、0.48±0.14、0.43±0.13、0.39±0.10、0.28±0.05。与空白组（0.37±0.03）相比,ET-1处理15min、30min后p-MYPT1表达水平显著增加,差异有统计学意义（P＜0.01）;随着时间的延长,p-MYPT1表达程度减弱,与对照组相比,差异无统计学意义（P＞0.05）。结论ET-1能够激活Rho激酶信号通路,且在一定浓度范围内具有诱导ASMC跨膜迁移的能力。Rho激酶信号通路抑制剂Y-27632显著抑制了ET-1诱导的ASMC迁移和细胞骨架的变化,提示Rho激酶信号通路在ET-1诱导的ASMC迁移中发挥重要的作用,这种作用可能通过细胞骨架的改变而介导的。

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