重组盘基网柄菌高密度发酵合成培养基的优化研究

论文摘要

盘基网柄菌Dictyostelium discoideum作为一个新兴的真核生物表达系统,用于表达需要翻译后修饰的药用蛋白具有广阔的应用前景,但其较慢的生长速度（代时为8-12h）以及较低的细胞密度(1-2×107mL-1)严重限制了它成为通用表达系统的应用。为有效利用盘基网柄菌这一真核表达系统生产异源蛋白诸如人类可溶性Fas配体,有必要实现盘基网柄菌的高密度悬浮培养。本文以可高通量表达人类可溶性Fas配体的重组盘基网柄菌AX3-pLu8为研究对象,以全合成SIH培养基为研究起点,通过优化培养基组成的方法改善其培养,提高细胞生长速度及细胞浓度。发展了柱前衍生反相高效液相色谱检测氨基酸的方法。采用2,4-二硝基氯苯为衍生剂,衍生方法简便,可同时对16种氨基酸进行定性分离和定量检测反应生成的DNP-氨基酸峰面积与氨基酸浓度具有良好的线性关系,线性相关系数在0.992～0.999之间。用该法分析重组盘基网柄菌AX3-pLu8对SIH培养基中氨基酸的利用情况,发现对赖氨酸的利用最为彻底,发酵末期赖氨酸被完全消耗;对蛋氨酸、色氨酸、精氨酸、组氨酸的利用也比较充分,在发酵末期这四种氨基酸的含量都降到初始含量的15%以下;而对天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、苏氨酸、脯氨酸、缬氨酸的需求不大,末期含量仍接近或高于初始含量的50%。采用单次单因素法,分析SIH培养基中各组分对AX3-pLu8细胞生长的影响。葡萄糖为细胞生长的必需营养成分,最佳的初始葡萄糖浓度在10g L-1左右。Mg2+对细胞生长有明显的促进作用,可显著提高最大细胞密度及缩短世代时间。最佳的Mg2+浓度为1.25 mmol L-1,这时最大细胞密度可达5.5×107mL-1,远高于在标准SIH培养基所能达到的培养水平3.5×107mL-1。Ca2+不是盘基网柄菌细胞生长的必需金属离子,且Ca2+浓度高于3.75 mmol L-1时对细胞生长有抑制作用。少量Fe3+的添加能显著提高细胞的生长速度,但对最大细胞密度影响不大;而高浓度的Fe3+对细胞生长出现明显的抑制作用,细胞几乎不生长,较适添加量为0.1mmol L-1。维生素中,生物素、叶酸及核黄素是AX3-pLu8生长的必需维生素,当培养基中缺少这三种维生素中的任何一种时,细胞几乎不生长,较适合的添加量为生物素10μgL-1,叶酸0.2mgL-1,核黄素2.5mgL-1。VB12和VB1均不是细胞生长所必需的维生素,且添加量对菌体生长影响不大。虽然AX3-pLu8在不添加硫辛酸时也能生长,但最大细胞密度仅能达到1.6×107mL-1,且硫辛酸的添加量对细胞密度的影响也较为明显,最佳硫辛酸浓度为0.4mgL-1。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 盘基网柄菌Dictyostelium discoideum介绍
• 1.1.1 盘基网柄菌的（无性）生命周期
• 1.1.2 盘基网柄菌的应用研究
• 1.2 盘基网柄菌表达系统
• 1.2.1 盘基网柄菌表达系统与各种通用表达系统的比较
• 1.2.2 重组盘基网柄菌表达异源蛋白质研究进展
• 1.2.3 重组盘基网柄菌表达人可溶性Fas配体
• 1.3 盘基网柄菌的培养研究进展
• 1.3.1 几种常用的盘基网柄菌培养基
• 1.3.2 限制细胞密度的自分泌因子
• 1.3.3 盘基网柄菌的高密度培养策略
• 1.4 本论文的研究内容及研究意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 重组盘基网柄菌AX3-pLu8的构建
• 2.2 实验材料和试剂
• 2.3 实验仪器
• 2.4 培养基和缓冲溶液
• 2.4.1 无菌培养基
• 2.4.2 缓冲溶液
• 2.5 菌种保存
• 2.5.1 磷酸盐-琼脂平板
• 2.5.2 盘基网柄菌的孢子收集方法
• 2.6 孢子活化和细胞对SIH培养基的适应
• 2.7 盘基网柄菌的悬浮培养
• 2.8 分析方法
• 2.8.1 细胞密度的测定
• 2.8.2 葡萄糖浓度的测定
• 2.8.3 氨浓度的测定
• 2.8.4 氨基酸浓度的测定
• 2.8.5 表达产物shFasL浓度的测定
• 2.9 微生物的生长动力学
• 2.10 数据模拟
• 第三章 重组盘基网柄菌AX3-pLu8对氨基酸的利用情况
• 3.1 氨基酸标准品的HPLC分析
• 3.1.1 混合氨基酸标准品的配制
• 3.1.2 流动相洗脱梯度的确定
• 3.1.3 混合氨基酸标准品的HPLC分析
• 3.1.4 标准曲线和精密度实验
• 3.2 SIH培养基中氨基酸成分的HPLC检测分析
• 3.3 重组盘基网柄菌AX3-pLu8对SIH培养基中氨基酸的利用情况
• 3.4 本章小结
• 第四章 培养基组成对重组盘基网柄菌AX3-pLu8生长的影响
• 4.1 重组盘基网柄菌AX3-pLu8在标准SIH培养基中的生长
• 4.2 葡萄糖对重组盘基网柄菌AX3-pLu8生长的影响
• 4.3 半胱氨酸对重组盘基网柄菌AX3-pLu8生长的影响
• 4.4 SIH培养基中无机盐组分对重组盘基网柄菌AX3-pLu8生长的影响
• 2+浓度对重组盘基网柄菌AX3-pLu8生长的影响'>4.4.1 Mg²⁺浓度对重组盘基网柄菌AX3-pLu8生长的影响
• 2+浓度对重组盘基网柄菌AX3-pLu8生长的影响'>4.4.2 Ca²⁺浓度对重组盘基网柄菌AX3-pLu8生长的影响
• 3+浓度对重组盘基网柄菌AX3-pLu8生长的影响'>4.4.3 Fe³⁺浓度对重组盘基网柄菌AX3-pLu8生长的影响
• 4.5 SIH培养基中维生素组分对重组盘基网柄菌AX3-pLu8生长的影响
• 4.5.1 生物素对重组盘基网柄菌AX3-pLu8生长的影响
• 12对重组盘基网柄菌AX3-pLu8生长的影响'>4.5.2 维生素B₁₂对重组盘基网柄菌AX3-pLu8生长的影响
• 4.5.3 叶酸对重组盘基网柄菌AX3-pLu8生长的影响
• 4.5.4 硫辛酸对重组盘基网柄菌AX3-pLu8生长的影响
• 4.5.5 核黄素对重组盘基网柄菌AX3-pLu8生长的影响
• 4.5.6 盐酸硫胺对重组盘基网柄菌生长的影响
• 4.6 本章小结
• 第五章 结论与展望
• 参考文献
• 附录
• 在读期间发表论文
• 致谢