PKZ在草鱼组织中表达及原子力显微镜观察PKZ PZa结合d（GC）13重组质粒

论文摘要

鲫鱼PKR-like（PKZ）蛋白的N-端由2个Z-DNA结合域（Za1和Za2）组成,属于Z-DNA结合蛋白家族之一。为更好理解鱼类PKZ的功能,本文进行了以下3个方面的工作。1、采用RT-PCR对草鱼在28℃水温下各组织中PKZ的表达差异性进行分析。发现水温在28℃时,该基因在各组织中都有微量的表达。当将水温迅速升温至34℃2h后,PKZ在各组织中表达都有所增强,其中以肾脏和脾脏的最为强烈。另一方面,Poly I∶C诱导草鱼2天后,该基因在各个所检组织中的表达量都有所提升,也在肾脏和脾脏表达最为强烈。2、克隆了并表达了鲫鱼PKZ的C端。C端结构域长度约为1kb,并将其连接到表达载体Pet32a,转化至表达菌BL21PlysS,IPTG诱导表达,His标签纯化,得到了一个约为53kD左右的蛋白。PKZ C端的表达和纯化为今后进一步对PKZ功能的研究提供了保证。3、在体外表达并纯化3种Za表达多肽(PZa1、PZa2、PZa1Za2)的基础上。用AFM观察分析PZa与pMD18-T/d（GC）13重组质粒的相互作用。结果显示:只有PZa1Za2与d（GC）13重组质粒有明显的结合,而PZa1、PZa2则不与它们结合。这与实验室先前用凝胶阻滞获得的实验结果一致。而且,PZa也对不含有d（GC）13序列的pMD18-T质粒没有结合能力。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 引言
• 1.1 Z-DNA特征及其分布
• 1.2 Z-DNA与基因表达调控
• 1.2.1 Z-DNA在转录调控中局部和普遍的超螺旋水平
• 1.2.2 Z-DNA和转录调控中的染色体重塑
• 1.2.3 Z-DNA与转录诱导和抑制
• 1.3 Z-DNA与遗传不稳定性
• 1.3.1 Z-DNA诱导遗传不稳定性
• 1.3.2 Z-DNA和哺乳动物细胞中DNA双链断裂
• 1.4 原子力显微镜（atomic force microscopy,AFM）和凝胶阻滞实验（band-shift assay）分析Zα与Z-DNA的结合
• 1.5 本研究的目的与意义
• 第2章 材料与方法
• 2.1 主要仪器设备
• 2.2 主要试剂、试剂盒
• 2.3 质粒和菌株
• Zα融合蛋白'>2.4 原核表达和纯化P_Zα融合蛋白
• 2.5 Bradford法测定蛋白质浓度
• 2.5.1 标准曲线的测定及样品的测定
• 2.5.2 数据处理
• 13重组质粒'>2.6 d（GC）₁₃重组质粒
• 2.7 AFM成像
• 2.7.1 样品处理
• 2.7.2 AFM制片
• 2.8 RT-PCR分析PKZ基因在草鱼组织中的表达
• 2.8.1 PKZ基因在草鱼组织中的本底表达特性分析
• 2.8.2 PKZ基因在草鱼组织中的诱导表达分析
• 2.9 PKZ的C端载体构建
• 第3章 实验结果
• Za'>3.1 蛋白原核表达及纯化P_Za
• 3.2 蛋白质浓度测定
• 13重组质粒的检测'>3.3 d（GC）₁₃重组质粒的检测
• Zα蛋白与质粒DNA的结合'>3.4 AFM观察P_Zα蛋白与质粒DNA的结合
• 3.5 PKZ基因在草鱼组织中表达特征分析
• 3.5.1 各组织总RNA的提取
• 3.5.2 PKZ基因表达特性分析
• 3.6 PKZ的C端克隆
• 3.6.1 PKZ的C端的获得
• 3.6.2 PKZ的C端克隆及验证
• 3.7 PKZ C端的表达蛋白的纯化
• 第4章 分析与讨论
• Zα与d（GC）₁₃重组质粒的结合的初步分析'>4.1 鲫鱼PKZ P_Zα与d（GC）₁₃重组质粒的结合的初步分析
• 4.2 PKZ在草鱼组织的表达
• 4.3 PKR-like（PKZ）的激酶催化功能研究
• 第5章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录 缩略语
• 攻读学位期间的研究成果