结核分枝杆菌磷酸葡糖胺变位酶在E.coli中的高表达

论文摘要

由于结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）的感染而引起的结核病（Tuberculosis, TB）已为全球性传染病,呈逐年增高趋势,给人类带来极大的危害,人们称之为白色瘟疫,其主要原因之一是由于耐多药（multi drug resistant, MDR）甚至是广泛耐药（extensive drug resistant, XDR）结核杆菌的出现,许多一线甚至一些二线抗结核药物都无法有效治疗结核病,因此寻找新的抗结核药物已迫在眉睫。结核分枝杆菌的细胞壁在其生存和增殖的过程中起着重要的作用,并且其细胞壁的结构和组成成分比较独特。其核心结构由肽聚糖、聚阿拉伯半乳糖和分枝菌酸组成。其中聚阿拉伯半乳糖与肽聚糖之间靠L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺双糖衔接分子连接。UDP-N-乙酰葡糖胺是N-乙酰葡糖胺的糖基供体,glmM基因（Rv3441c）编码的磷酸葡糖胺变位酶催化UDP-N-乙酰葡糖胺生物合成过程中葡糖胺-6-磷酸转化为葡糖胺-1-磷酸的反应,并且此反应在人体内不存在,因此磷酸葡糖胺变位酶可作为理想的新型抗结核药的靶标。为了测定磷酸葡糖胺变位酶的空间结构,定向设计酶的抑制剂,需要获得足够量的GlmM蛋白,为此,我们设计了此课题进行实验,首先克隆编码结核分枝杆菌磷酸葡糖胺变位酶的glmM基因,然后在大肠杆菌中高效表达GlmM蛋白质,分离纯化后获得足量的GlmM蛋白质。本论文的目的是:从结核分枝杆菌基因组DNA中克隆磷酸葡糖胺变位酶基因（glmM）,并利用pEHisTEV表达载体在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中高效表达glmM基因产物-磷酸葡糖胺变位酶,为进一步测定磷酸葡糖胺变位酶的空间结构及酶促反应动力学提供物质保障。本文所使用的方法:（1）利用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv菌株的基因组DNA中扩增出Tb glmM基因;（2）将Tb glmM基因克隆到pSTBlue 1克隆载体中,经DNA序列测定证实为正确的基因;（3）将Tb glmM基因亚克隆到pEHisTEV表达载体中,并在大肠杆菌BL21（DE3）中表达Tb GlmM蛋白质; （4）用French Press方法破碎诱导的大肠杆菌BL21（DE3）细胞,并进行SDS-PAGE电泳分析。本文所获得的结果如下:1.利用PCR方法对目的glmM基因的扩增从结核分枝杆菌H37Rv菌株基因组数据库（http://genolist.pasteu- r.fr/TubercuList/）中获得Tb glmM基因的核苷酸序列（1347 bp）。根据其核苷酸序列设计一对PCR引物,并在上游引物和下游引物的5’端分别引入了NcoI和HindIII限制性酶切位点,以便将Tb glmM基因克隆到pEHisTEV表达载体的NcoI和HindIII位点。以H37Rv菌株基因组DNA为模板,用Expand HF Enzyme Mix成功的扩增出Tb glmM基因。2. pSTBlue 1-Tb glmM的构建及核苷酸序列的测定将纯化的PCR产物进行末端补平后与pSTBlue 1载体进行连接,将连接产物转化到大肠杆菌DH5α菌株的感受态细胞中。用限制性内切酶酶切方法鉴定出阳性重组质粒pSTBlue 1-Tb glmM。对pSTBlue 1-Tb glmM中的Tb glmM基因进行DNA序列测定,对DNA序列结果进行Multalin分析,结果表明所克隆的Tb glmM基因与结核分枝杆菌H37Rv菌株基因组数据库中glmM基因的核苷酸序列完全一致,表明利用PCR技术扩增出的Tb glmM基因不存在任何碱基突变。3.表达载体pEHisTEV-Tb glmM的构建用NcoI和HindIII双酶切pSTBlue 1-Tb glmM阳性重组质粒,回收纯化Tb glmM基因后,将Tb glmM基因连接到表达载体pEHisTEV的NcoI和HindIII位点,并用连接产物转化DH5α菌株的感受态细胞。用NcoI和HindIII双酶切方法鉴定重组表达载体pEHisTEV-Tb glmM,表达载体中的Tb glmM基因产物的N端与pEHisTEV表达载体上的6个连续组氨酸标记及TEV （tobacco etch virus,烟草蚀纹病毒）蛋白酶识别序列形成融合蛋白,便于目的蛋白的纯化和组氨酸标记的去除。4. Tb GlmM蛋白质在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达将pEHisTEV质粒及pEHisTEV-Tb glmM质粒分别转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中。用IPTG诱导Tb glmM的表达。用French Press方法破碎诱导的大肠杆菌BL21（DE3）细胞,对上清和沉淀组分进行SDS-PAGE电泳分析,结果表明Tb GlmM酶蛋白在BL21（DE3）大肠杆菌中高表达。本文所获得的结论如下:1.用具有高保真性DNA聚合酶（Expand HF Enzyme Mix）从结核分枝杆菌基因组中成功地扩增出glmM基因,并构建了pEHisTEV-Tb glmM表达载体。2.在大肠杆菌BL21（DE3）中高表达出结核分枝杆菌Tb GlmM蛋白质,并用镍离子亲和层析柱纯化了Tb GlmM蛋白质。这一研究成果为我们进一步测定磷酸葡糖胺变位酶的空间结构及研究其酶促反应动力学特性提供了物质保障。

论文目录

• 一、正文
• （一） 中文摘要
• （二） 英文摘要
• （三） 前言
• （四） 材料与方法
• （五） 结果
• （六） 讨论
• （七） 结论
• （八） 参考文献
• 二、文献综述
• （一） 综述
• （二） 参考文献
• 三、致谢