抗氯霉素单克隆抗体的制备与纯化研究

论文摘要

氯霉素（Chloramphenicol,CAP）是一种高效广谱性抗生素,对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有很好的抑制作用,因此作为细菌性疾病的治疗药物和饲料添加剂分别应用于人和动物。但是氯霉素对人体有较强的副作用与毒性,会导致再生障碍性贫血和粒细胞缺乏症而被禁止使用。然而,由于其优良的抗菌性、稳定的药性和低廉的价格,在畜牧业及人工养殖业中仍然违法使用。目前,用于检测氯霉素残留的分析方法有色谱法、微生物法、免疫分析方法等。其中免疫分析方法是最理想的残留筛选分析方法之一,因此,研制高纯度的氯霉素单克隆抗体对动物性食品及其食用组织中氯霉素检测有重要的意义。本研究利用细胞融合技术将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经筛选、单克隆化获得了能稳定分泌CAP单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并制备了含氯霉素单克隆抗体的腹水,考察了小鼠周龄、性别、诱导剂等因素对腹水制备的影响。采用硫酸铵沉淀、辛酸-硫酸铵沉淀、蛋白A亲和层析、辛酸-QSepharose等纯化方法对其进行纯化,通过比较和优化,建立了良好的纯化CAP单克隆抗体的方法。主要实验结果如下:1.获得两株能稳定分泌抗CAP单克隆抗体的杂交瘤细胞株1D1,3G12,细胞培养上清液中抗体效价达10-4,腹水抗体效价达10-8。2.弗氏不完全佐剂预处理的小鼠比石蜡预处理的小鼠腹水产量高;10～12周龄小鼠腹水产量高于6～8周龄小鼠;雄性小鼠腹水产量显著高于雌性小鼠腹水产量。腹水经辛酸-硫酸铵沉淀法纯化后抗体纯度大于硫酸铵沉淀法,抗体纯度达78%,抗体回收率达41%,纯化后抗体的生物学活性良好。3.腹水经辛酸沉淀后上清用磷酸缓冲液（pH8.0,20mmol/LPB）上样于自装的Q Sepharose FF离子交换层析柱,pH8.0,20 mmol/L PB +0.8mol/L NaCl一步梯度洗脱,可获得纯度达90%的mAb,抗体回收率达75%,纯化后的抗体生物活性好且特异性强。4.腹水用磷酸缓冲液（pH7.0,20mmol/LPB + 3mol/LNaCl）上样于HiTrap rProtein A FF预装亲和层析柱,pH3.0,0.1 mol/LGly-HCl一步洗脱,回收抗体的纯度大于95%,抗体回收率达80%,纯化后的抗体生物活性好且特异性强。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 论文中术语、缩略语一览表
• 前言
• 第一章 绪论
• 1.1 氯霉素
• 1.1.1 氯霉素的结构、应用及危害
• 1.1.2 氯霉素的检测方法
• 1.2 单克隆抗体的制备及其应用
• 1.3 单克隆抗体的分离纯化
• 1.3.1 盐析法
• 1.3.2 有机溶剂沉淀法
• 1.3.3 亲和层析
• 1.3.4 疏水层析
• 1.3.5 固定化金属螯合层析
• 1.3.6 离子交换层析
• 1.3.7 凝胶过滤层析
• 1.4 本课题的研究内容
• 第二章 分泌抗氯霉素单克隆抗体杂交瘤细胞的制备
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 细胞株、实验动物
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 免疫动物
• 2.2.2 饲养层细胞的制备
• 2.2.3 细胞融合
• 2.2.4 HAT培养基选择杂交瘤细胞
• 2.2.5 抗体的检测
• 2.2.6 杂交瘤细胞的单克隆化
• 2.2.7 蛋白含量测定
• 2.2.8 单克隆抗体效价的测定
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 小鼠血清抗体效价检测
• 2.3.2 杂交瘤细胞株的建立
• 2.3.3 杂交瘤细胞上清蛋白含量及抗体效价的检测
• 第三章 氯霉素单克隆抗体腹水的制备及初步纯化
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 实验动物
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 F1小鼠的分组
• 3.2.2 杂交瘤细胞的培养与接种
• 3.2.3 收集腹水
• 3.2.4 硫酸铵沉淀法纯化腹水单克隆抗体
• 3.2.5 辛酸-硫酸铵沉淀法
• 3.2.6 蛋白含量测定
• 3.2.7 SDS-PAGE凝胶电泳法计算抗体蛋白纯度及回收率
• 3.2.8 mAb活性的测定
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 诱导剂对小鼠腹水产量的影响
• 3.3.2 性别对小鼠腹水产量的影响
• 3.3.3 周龄对小鼠腹水产量的影响
• 3.3.4 硫酸铵沉淀法纯化腹水中单克隆抗体
• 3.3.5 辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水中单克隆抗体
• 第四章 应用蛋白A亲和层析法纯化氯霉素单克隆抗体
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 试剂
• 4.1.2 仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 腹水样品的预处理
• 4.2.2 亲和层析过程
• 4.2.3 考察上样缓冲溶液pH对抗体吸附的影响
• 4.2.4 考察上样缓冲溶液离子强度对抗体吸附的影响
• 4.2.5 考察洗脱液pH对抗体洗脱的影响
• 4.2.6 流速对抗体吸附洗脱的影响
• 4.2.7 蛋白含量测定
• 4.2.8 单克隆抗体纯度和回收率的鉴定
• 4.2.9 单克隆抗体活性的测定
• 4.2.10 单克隆抗体特异性的测定
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 上样缓冲溶液pH对抗体吸附的影响
• 4.3.2 上样缓冲溶液离子强度对抗体吸附的影响
• 4.3.3 洗脱液pH对抗体洗脱的影响
• 4.3.4 流速对抗体吸附洗脱的影响
• 4.3.5 纯化后抗体活性的检测
• 4.3.6 单克隆抗体特异性测定
• 第五章 辛酸-Q离子交换串联纯化氯霉素单克隆抗体
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 mAb来源
• 5.1.2 试剂
• 5.1.3 仪器
• 5.2 试验方法
• 5.2.1 色谱柱的制备
• 5.2.2 辛酸沉淀
• 5.2.3 阴离子交换层析过程
• 5.2.4 影响Q Sepharose阴离子交换柱纯化抗体因素的考察
• 5.2.5 蛋白含量测定
• 5.2.6 单克隆抗体纯度和回收率的鉴定
• 5.2.7 单克隆抗体活性的测定
• 5.2.8 单克隆抗体特异性的测定
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 上样缓冲液pH对抗体吸附的影响
• 5.3.2 洗脱体积对抗体纯化效果的影响
• 5.3.3 洗脱液的盐浓度对抗体纯化效果的影响
• 5.3.4 纯化后抗体活性的检测
• 5.3.5 单克隆抗体特异性测定
• 第六章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 参考文献
• 附常用试剂的配制
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表论文情况