D-氨基酸氧化酶的表达纯化及酶学特性研究

论文摘要

D-氨基酸氧化酶（D-AAOs,EC1.4.3.3）是一种黄素酶类,可氧化D-氨基酸的氨基生成相应的酮酸和氨,在体内D-氨基酸代谢中起着重要作用,并广泛存在于生物界中。从众多的研究结果看来,到目前为止对来源于原核生物的D-氨基酸氧化酶的研究进行的比较少,2006年才首次从原玻璃蝇节杆菌属Arthrobacter protophormiae中分离得到该酶的基因并对其进行了初步的研究,这是迄今为止唯一一个针对原核生物D-氨基酸氧化酶的研究报道。本研究通过从原玻璃蝇节杆菌属A. protophormiae （DSM20168）中克隆得到D-氨基酸氧化酶基因,并对其进行定点突变,最后对野生型和突变型DAAO进行了初步的酶学特性鉴定,不仅是源于原核生物D-氨基酸氧化酶研究的补充,同时为构建更多有利于人们生产生活的突变体和重组体酶做出了初步探索。实验结果如下：首先,参考已报道的原玻璃蝇节杆菌中D-氨基酸氧化酶基因（GeneBank accession No:AY306197）的信息设计了引物并加入了Nde和XhoI酶切位点,用PCR方法扩增出得到了原玻璃蝇节杆菌A. protophormiae （DSM20168）的D-氨基酸氧化酶基因（Apdaao）,将其克隆到pMD-19T载体上经过DNA测序,序列正确后再将其克隆到pET22b+中获得表达载体pET Apdaao,将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,对其进行诱导表达,在诱导菌初始菌浓度OD600为0.5左右时,加入0.5mM的诱导剂IPTG,在30℃下继续培养10-12h,表达D-氨基酸氧化酶。其次,我们设计了四对定点突变的引物,通过重叠法PCR和一步法PCR得到了四个突变体质粒pET-E115A、pET-N119D、pET-T256K和pET-T286A,测序正确后将突变体质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中经IPTG诱导表达。蛋白粗提液经Ni-NTA亲和层析柱纯化后得到较纯的D-氨基酸氧化酶溶液,并进行初步的酶学特性分析研究。结果表明：本研究得到的野生型及突变型DAAO酶均在20-40℃时稳定,反应最适温度为30℃；野生型的反应最适pH值为10,突变型酶在pH值为8-9时具有较高活力；而在底物特异性方面,与已报道的来源于同菌属的DAAO相比,本研究所用DAAO存在一定差异,尤其对D-Ala、D-Phe和D-Lys的变化较为明显。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 引言
• 1.1 生物学特性及应用
• 1.1.1 食品质量检测
• 1.1.2 精神疾病及癌症的治疗
• 1.1.3 纯化消旋混合物及新药开发
• 1.1.4 两步酶法生产7-aminocephalosporanic acid（7-ACA）
• 1.1.5 生物传感器
• 1.2 D-氨基酸氧化酶表达条件的优化
• 1.2.1 培养条件的筛选与优化
• 1.2.2 改变细胞通透性的研究
• 1.3 D-氨基酸氧化酶的定点突变及酶学特性研究
• 1.3.1 纤细红酵母RgDAAO定点突变及底物特异性研究
• 1.3.2 三角酵母TvDAAO定点诱变改变底物特异性的研究
• 第二章 原玻璃蝇节杆菌D-氨基酸氧化酶基因的表达及纯化
• 前言
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌种与质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 溶液
• 2.1.4 酶和生化试剂
• 2.1.5 DNA操作
• 2.1.5.1 总DNA的提取
• 2.1.5.2 DNA浓度和纯度的测定
• 2.1.5.3 质粒DNA的提取和纯化
• 2.1.5.4 试剂盒提取质粒DNA
• 2.1.5.5 酒精沉淀法纯化DNA
• 2.1.5.6 DNA酶切、回收、转化等
• 2.1.6 实验所用引物
• 2.1.7 D-氨基酸氧化酶基因克隆
• 2.1.8 序列测定和分析
• 2.1.9 D-氨基酸氧化酶活性分析
• 2.1.10 D-氨基酸氧化酶的表达与纯化
• 2.1.10.1 D-氨基酸氧化酶的诱导培养
• 2.1.10.2 Ni-NTA亲和层析柱纯化蛋白
• 2.1.10.3 蛋白纯度鉴定和浓度测定
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 Apdaao基因的PCR扩增结果及pETApdaao双酶切验证结果
• 2.2.2 Apdaao基因序列测序结果及比对结果
• 2.2.3 DAAO纯化结果
• 2.3 小结
• 第三章 D-氨基酸氧化酶基因的定点突变
• 前言
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 工具酶和试剂
• 3.1.1.1 DNA聚合酶及增强剂
• 3.1.1.2 限制性内切酶及消化酶
• 3.1.1.3 试剂盒
• 3.1.2 定点突变引物设计
• 3.1.3 重叠延伸法定点突变
• 3.1.3.1 退火温度的测定
• 3.1.3.2 目的片段的克隆
• 3.1.3.3 目的片段与克隆载体的连接及验证
• 3.1.3.4 目的基因的表达
• 3.1.4 试剂盒法（一步法）定点突变
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 重叠法构建T286A突变体
• 3.2.1.1 T286A的PCR结果
• 3.2.1.2 T286A的测序及比对结果
• 3.2.2 一步法构建E115A、N119D、T256K突变体
• 3.2.2.1 E115A、N119D、T256K的PCR扩增结果及酶切验证结果
• 3.2.2.2 测序及比对结果
• 3.2.3 突变体酶蛋白纯化结果
• 3.3 小结
• 第四章 D-氨基酸氧化酶的酶学特性研究
• 前言
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 本研究所用D-氨基酸氧化酶
• 4.1.1.1 培养条件
• 4.1.1.2菌体收集破碎及酶的纯化
• 4.1.1.3 蛋白纯度鉴定和浓度测定
• 4.1.2 实验方法
• 4.1.2.1 底物特异性实验
• 4.1.2.2 反应最适pH值
• 4.1.2.3 反应最适温度
• 4.1.2.4 pH稳定性
• 4.2 实验结果与分析
• 4.2.1 底物特异性
• 4.2.2 最适反应温度
• 4.2.3 最适反应pH
• 4.2.4 pH稳定性
• 4.3 小结
• 第五章 实验结果及展望
• 5.1 实验结果汇总
• 5.1.1 野生型D-氨基酸氧化酶基因的表达及纯化
• 5.1.1.1 野生型D-氨基酸氧化酶基因的克隆及载体构建
• 5.1.1.2 野生型D-氨基酸氧化酶的表达纯化
• 5.1.2 突变体D-氨基酸氧化酶基因的表达及纯化
• 5.1.2.1 突变体D-氨基酸氧化酶基因的获得
• 5.1.2.2 突变体D-氨基酸氧化酶的表达纯化
• 5.1.3 D-氨基酸氧化酶的基本酶学特性分析
• 5.1.3.1 底物特异性研究
• 5.1.3.2 反应最适温度
• 5.1.3.3 反应最适pH值
• 5.1.3.4 反应pH值稳定性
• 5.2 总结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录A
• 附录B