论文摘要
目的：通过阻断PD-L1在人胎盘间充质干细胞（human placenta mesenchymal stem cells, HPMSCs）上的表达,研究其在HPMSCs上表达的生物学意义,包括PD-L1对HPMSCs黏附和迁移能力的影响以及在HPMSCs对T细胞的免疫调节中的作用。方法：（1）细胞的分离与鉴定：采用酶消化法从健康人胎盘组织中分离细胞,体外培养3代后用于实验。免疫荧光标记和流式细胞术（FCM）检测细胞表面抗原表达,用FCM及RT-PCR检测PD-L1的表达；（2）阻断PD-L1的表达：通过脂质体途径将PD-L1siRNA转染入HPMSCs,并用RT-PCR检测阻断后PD-L1的基因表达；（3）HPMSCs的黏附和迁移检测：阻断PD-L1的表达后,细胞计数法检测HPMSCs的黏附率；Transwell法检测HPMSCs在DMEM-LG完全培养基、DMEM-LG完全培养基（含SDF-1α）、HPMSCs培养上清3种培养条件下的迁移数量。（4）人外周血单个核细胞（PBMC）的分离与共培养：用密度梯度离心法分离PBMC,与阻断PD-L1后的HPMSCs进行共培养,并用PHA或PMA刺激活化；（5）T细胞的活化表型、增殖、周期及对细胞因子分泌的检测：荧光抗体标记法和FCM分析T细胞早期活化表型CD69的表达及T细胞的周期；用CFSE标记方法测定T细胞的增殖；细胞胞内染色法检测T细胞对IL-17的分泌。结果：（1）胎盘组织来源的间充质干细胞均匀贴壁生长、呈成纤维细胞状、表达CD44、CD105、CD166、而不表达CD14、CD34和CD45分子。（2）HPMSCs高表达PD-L1,通过脂质体途径可以将PD-L1siRNA高效转入细胞,且能有效阻断PD-L1在细胞上的表达。（3）阻断组细胞在接种后0.5h的黏附率与未阻断组无明显差异,但在接种后1h、3h阻断组细胞的黏附率均明显高于未阻断组p<0.05)；在3种培养条件下,阻断组细胞的迁移数量比未阻断组显著减少（p<0.01）。（4）阻断组CD69的表达与未阻断组相比无明显变化；（5）与未阻断组相比,阻断组的T细胞增殖明显增加,但仍低于单纯PMA刺激组；细胞周期分析结果显示,与未阻断组相比,处于G0/G1期的T细胞比未阻断组明显减少,处于S期的T细胞明显增加,但与单纯PMA刺激组相比仍有明显差异；（6）在HPMSCs存在条件下,T细胞对IL-17的分泌明显增加,阻断PD-L1的表达后,T细胞对IL-17的分泌进一步增加。结论：通过siRNA技术能有效阻断PD-L1在HPMSCs上的表达。阻断PD-L1的基因表达后,能够使HPMSCs的黏附能力增强、迁移能力下降,能够部分逆转HPMSCs对T细胞的增殖及周期的免疫抑制作用,能够上调HPMSCs对T细胞分泌IL-17的促进作用。以上实验结果表明,（1）PD-L1参与了HPMSCs的黏附和迁移；（2）PD-L1能够协同HPMSCs对T细胞增殖及周期的抑制作用；（3）HPMSCs上调CD4+T细胞对IL-17的分泌作用,但PD-L1可抑制HPMSCs对CD4+T细胞分泌IL-17的调节作用；（4）PD-L1对HPMSCs对T细胞活化表型CD69的表达调节无明显影响。