离子液体用于核酸和蛋白质萃取分离与富集的研究

论文摘要

核酸、蛋白质等生命物质的分析检测对阐述生命现象以及临床诊断、疾病治疗等均具有重要的意义。在实际生物样品中DNA、蛋白质与基体组分混合共存,要对这些生命物质进行分析检测,需要将其从复杂的样品基体中分离出来。然而在经典的液相萃取分离方法中,易挥发、有毒有机溶剂的使用不仅带来环境污染,而且对生命物质有一定的毒性作用。因此,建立环境友好的绿色萃取分离新方法十分重要。离子液体作为一种新型绿色溶剂,具有良好的热稳定性、低蒸汽压和不挥发性等特性。以离子液体为溶剂替代传统的有机溶剂萃取分离生命物质,即可减少环境污染,又能克服有机溶剂对生命物质的毒性。本论文拟采用离子液体对生命物质DNA、蛋白质进行分离萃取,以建立绿色的萃取分离和富集方法,并探讨离子液体与生命物质相互作用的有关信息,为生命物质的分析检测提供理论基础。本论文主要对以下几方面的工作进行了研究：（1）研究了疏水性离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐（BmimPF6）对DNA的萃取分离富集,发现在室温下无需其他任何辅助萃取剂,用200μl离子液体与700μl水溶液混合萃取10分钟,10 ngμl-1 DNA的萃取率可达到95%以上。用磷酸氢二钾-柠檬酸缓冲溶液可将一部分DNA从离子液体中反萃取出来。核磁共振和红外光谱研究证明,在萃取过程中DNA分子中的磷酸基团的氧原子与离子液体的阳离子Bmim+发生键合反应,生成的DNA-Bmim加合物有利于DNA向离子液体相中转移。（2）实验发现在离子液体中,DNA-EB（溴化乙锭）体系的共振光散射强度随DNA浓度增大而降低,据此建立了直接定量离子液体相中DNA的共振光散射方法。共振光散射强度降低的原因是由于在离子液体中DNA与EB的作用方式与在水溶液中不同所致。在离子液体相中,咪唑阳离子插入到DNA双螺旋结构中,阻止了EB与DNA的嵌入反应。此时EB和DNA之间仅发生静电相互作用,并导致EB在DNA表面局部浓集。DNA浓度增大使EB的聚集加剧,此时EB分子自身的光吸收明显增强,而内滤效应使共振光散射强度降低。（3）以不同烷基侧链的咪唑类疏水性离子液体为萃取溶剂研究了对蛋白质的萃取。在无需添加任何辅助萃取剂的情况下,血红蛋白可以被选择性地萃取到离子液体1-丁基-3-甲基硅咪唑六氟磷酸盐（BtmsimPF6）中,而白蛋白、转铁蛋白、细胞色素C等不能被直接萃取。用400μl离子液体萃取3 ml水溶液中100 ngμl-1的血红蛋白（pH 6.7）,萃取30分钟后血红蛋白的萃取率在95%以上。离子液体中20 ngμl-1的血红蛋白可用0.6%的SDS反萃取,反萃取率约为85%。穆斯堡尔谱和圆二色光谱（CD）研究表明,在萃取过程中血红蛋白中血红素分子的铁原子与离子液体中的咪唑阳离子发生轨道杂化,咪唑阳离子垂直于血红素分子平面与铁原子配位,从而有利于血红蛋白向离子液体相的转移。（4）对细胞色素C的萃取研究表明,在酸性条件下离子液体BtmsimPF6能部分萃取细胞色素C。当细胞色素C水溶液的浓度为5 ngμl-1,体积3 ml,溶液pH为1时,用400μl离子液体萃取30分钟,萃取率为85%。20 ngμl-1细胞色素C被400μl离子液体萃取后,再用3 ml二次去离子水反萃取30分钟,反萃取率为33%。紫外和CD光谱研究发现在酸性条件下,细胞色素C构型发生转变使疏水性基团外露；当溶液pH值小于2时,血红素基团的铁原子与甲硫氨酸的第6个配位键断裂,提供一个空配位,与离子液体的咪唑阳离子发生配位作用,从而促使细胞色素C进入离子液体中。（5）研究了不同烷基侧链的咪唑类离子液体的荧光光谱,发现具有共轭结构的咪唑类离子液体能发射明显的荧光,且荧光强度随咪唑烷基侧链、溶液极性、溶液pH值的增大而明显增强,但血红蛋白能明显地猝灭离子液体的荧光。基于此,将离子液体1,3-二丁基咪唑六氟磷酸盐（BBimPF6）作为一种荧光探针应用于血红蛋白的分析测定。当溶液pH为7时,血红蛋白对离子液体饱和水溶液荧光猝灭的线性范围为15-100 ngμl-1,检出限为5.0ngμl-1,相对标准偏差为3.2%（50 ngμl-1,n=11）。机理研究表明,离子液体的咪唑阳离子与血红蛋白中的铁原子发生配位作用,生成的配合物荧光降低从而导致荧光猝灭,其猝灭类型可能为静态猝灭和能量转移猝灭。该方法已用于全血样品中血红蛋白含量的测定。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 第1章 离子液体及生物分子萃取分离概述
• 1.1 离子液体
• 1.1.1 离子液体的种类及性质
• 1.1.2 离子液体的合成
• 1.1.2.1 卤代盐离子液体
• 1.1.2.2 含氟离子液体
• 1.1.2.3 功能化离子液体
• 1.1.2.4 其他离子液体
• 1.1.3 离子液体的应用
• 1.1.3.1 有机合成
• 1.1.3.2 电化学
• 1.1.3.3 萃取分离
• 1.2 生物分子的萃取分离
• 1.2.1 液相萃取
• 1.2.2 固相萃取
• 1.2.3 其他萃取分离技术
• 1.3 离子液体在生物分子萃取分离中的应用
• 1.4 展望
• 1.5 本论文工作的研究内容
• 参考文献
• 6）萃取DNA的研究'>第2章 离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐（BmimPF₆）萃取DNA的研究
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 仪器
• 2.2.2 试剂
• 6）的合成'>2.2.3 离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐（BmimPF₆）的合成
• 2.2.4 实验操作步骤
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 DNA萃取率及分配系数
• 2.3.2 萃取时间对萃取率的影响
• 2.3.3 温度对萃取平衡的影响
• 2.3.4 pH值对萃取率的影响
• 2.3.5 反萃取
• 2.3.6 萃取机理的研究
• 31P-NMR测定'>2.3.6.1³¹P-NMR测定
• 2.3.6.2 红外光谱测定
• 2.4 全血样品中DNA的萃取分离
• 2.5 结论
• 参考文献
• 第3章 离子液体中DNA的测定方法研究
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 仪器
• 3.2.2 试剂
• 6）的合成'>3.2.3 离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐（BmimPF₆）的合成
• 3.2.4 实验操作步骤
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 DNA-EB体系的共振光光谱
• 3.3.2 DNA-EB的结合方式
• 3.3.3 EB共振光散射光谱
• 3.3.4 萃取pH值对DNA-EB体系共振光的影响
• 3.3.5 离子液体的量对共振光的影响
• 3.3.6 共振光散射测定离子液体中DNA方法的性能分析
• 3.4 全血样品中DNA的测定
• 3.5 结论
• 参考文献
• 6）萃取血红蛋白的研究'>第4章 离子液体1-丁基-3-三甲基硅咪唑六氟磷酸盐（BtmsimPF₆）萃取血红蛋白的研究
• 4.1 引言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 仪器
• 4.2.2 试剂
• 4.2.3 离子液体的合成
• 6）的合成'>4.2.3.1 1-丁基-3-三甲基硅咪唑六氟磷酸盐（BtmsimPF₆）的合成
• 6）的合成'>4.2.3.2 1,3-二丁基咪唑六氟磷酸盐（BBimPF₆）的合成
• 6）的合成'>4.2.3.3 1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐（BmimPF₆）的合成
• 4.2.4 实验操作步骤
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 不同离子液体对几种蛋白质的萃取
• 4.3.2 离子液体萃取血红蛋白
• 4.3.3 离子液体体积对萃取率的影响
• 4.3.4 萃取时间对萃取率的影响
• 4.3.5 反萃取
• 4.3.6 萃取机理的研究
• 4.3.6.1 静电吸引作用
• 4.3.6.2 共价配位作用
• 4.3.6.3 紫外-可见光谱
• 4.3.6.4 荧光光谱
• 57Fe穆斯堡尔谱'>4.3.6.5⁵⁷Fe穆斯堡尔谱
• 4.3.6.6 血红素中铁原子的第六空配位
• 4.4 全血样品中血红蛋白的萃取分离
• 4.5 结论
• 参考文献
• 6）萃取细胞色素C的研究'>第5章 离子液体1-丁基-3-三甲基硅咪唑六氟磷酸盐（BtmsimPF₆）萃取细胞色素C的研究
• 5.1 引言
• 5.2 实验部分
• 5.2.1 仪器
• 5.2.2 试剂
• 6）的合成'>5.2.3 1-丁基-3-三甲基硅咪唑六氟磷酸盐（BtmsimPF₆）的合成
• 5.2.4 实验操作步骤
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 pH值对萃取率的影响
• 5.3.2 细胞色素C浓度对萃取率的影响
• 5.3.3 离子液体体积对萃取率的影响
• 5.3.4 萃取时间对萃取率的影响
• 5.3.5 反萃取
• 5.3.6 萃取机理研究
• 5.4 结论
• 参考文献
• 第6章 离子液体荧光及血红蛋白诱导荧光猝灭研究
• 6.1 引言
• 6.2 实验部分
• 6.2.1 仪器
• 6.2.2 试剂
• 6.2.3 离子液体的合成
• 6）的合成'>6.2.3.1 1-丁基-3-三甲基硅咪唑六氟磷酸盐（BtmsimPF₆）的合成
• 6）的合成'>6.2.3.2 1,3-二丁基咪唑氯代盐（BBimCl）及六氟磷酸盐（BBimPF₆）的合成
• 6）的合成'>6.2.3.3 1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐（BmimPF₆）的合成
• 6.2.4 实验操作步骤
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 离子液体的荧光光谱
• 6的荧光发射光谱'>6.3.1.1 BmimPF₆的荧光发射光谱
• 6的荧光发射光谱'>6.3.1.2 BBimPF₆的荧光发射光谱
• 6的荧光发射光谱'>6.3.1.3 BtmsimPF₆的荧光发射光谱
• 6.3.1.4 BmimCl的荧光发射光谱
• 6.3.1.5 离子液体的最大发射波长和荧光强度
• 6.3.1.6 pH值对离子液体BBimCl荧光强度的影响
• 6.3.1.7 溶剂对离子液体BBimCl的荧光发射光谱的影响
• 6.3.2 血红蛋白诱导离子液体荧光猝灭
• 6.3.2.1 荧光猝灭类型
• 6.3.2.2 静态猝灭
• 6.3.2.3 动态猝灭
• 6.3.2.4 能量转移猝灭
• 6.3.2.5 猝灭机理
• 6.3.2.6 荧光猝灭法测定血红蛋白的方法性能分析
• 6.4 荧光猝灭法选择性测定全血样品中的血红蛋白
• 6.5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表论文目录