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重组人角质细胞生长因子-I聚乙二醇修饰及体内外活性研究

2020-12-10阅读(181)

重组人角质细胞生长因子-I聚乙二醇修饰及体内外活性研究

论文摘要

目的：研究大肠杆菌可溶性表达的重组人角质细胞生长因子-I型N端缺失23个氨基酸后的突变体（△N23KGF-I，简称△K23）的聚乙二醇修饰、纯化工艺及其体内外生物活性。方法：（1）破菌，SP sepharose F.F纯化，复性和Heparinsepharose F.F纯化得到突变体纯品；（2）用mPEG-马来酰亚胺修饰截短重组人角质细胞生长因子-I（△K23）的游离巯基，然后胰蛋白酶酶切，采用液质联用技术，获得质量肽图。对比单体及修饰后的蛋白还原质量肽图和非还原质量肽图，确定PEG的修饰位点；（3）通过NBL-7细胞、大鼠五氟尿嘧啶肠粘膜损伤模型进行体内外生物活性评价。结果：获得的△K23单体的纯度能达到95%，工艺稳定；通过对修饰工艺的研究，得到了两个不同的修饰产物：mPEG-Mal-△K23-40（缩写：PEG-K23-40）、mPEG-Mal-△K23-102（缩写：PEG-K23-102）。前者修饰在Cys40位，后者修饰在Cys102位，100mg级△K23样品修饰后纯度达到95%以上，而且修饰位点单一。经体外的NBL-7的细胞测活，△K23和PEG-K23-40、PEG-K23-102的活性保留了以KGF-1国际标准品作为对照品的生物活性的98%，65%，30%。在大鼠的肠粘膜损伤修复实验中，△K23和PEG-K23-40相对于模型组有明显的效果，PEG-K23-102的效果则不明显。结论：在非常规的PEG修饰条件下，首次成功的修饰了△N23KGF-I的两个半胱氨酸残基，并得到了高纯度，修饰位点单一的两种修饰产物：PEG-K23-40、PEG-K23-102。经体外活性的结果分析，PEG-K23-40初步证明有效，活性保留了65%。在体内活性方面，相对于模型组，PEG-K23-40也确实对粘膜损伤有修复作用，可以作为针对粘膜损伤的长效候选药物。在相同条件下，PEG-K23-102作用不明显，其其他的生物活性则有待研究。

论文目录

  • 中文摘要
  • Abstract
  • 英文缩略表
  • 第1章 引言
  • 1.1 角质细胞生长因子
  • 1.1.1 人角质细胞生长因子的发现
  • 1.1.2 KGF-1 和 KGFR 的结构
  • 1.1.2.1 分子结构
  • 1.1.2.2 KGF-1 受体（KGFR）
  • 1.1.3 KGF-1 理化性质
  • 1.1.4 KGF-1 生物学活性
  • 1.1.4.1 KGF-1 作用原理
  • 1.1.4.2 KGF-1 生物学活性
  • 1.1.4.3 KGF-1 与肿瘤发生
  • 1.1.4.4 KGF 与免疫调节
  • 第2章 立题意义和研究任务
  • 2.1 立题意义
  • 2.2 本课题研究的目的
  • 2.3 本课题研究的主要内容
  • 2.4 技术路线
  • 第3章 截短型人角质细胞生长因子纯化研究
  • 3.1 试剂与仪器
  • 3.1.1 主要试剂
  • 3.1.2 主要仪器
  • 3.1.3 检测方法
  • 3.1.3.1 SDS-PAGE 凝胶电泳检测
  • 3.1.3.2 Lowry 法测蛋白浓度
  • 3.1.3.3 RP-HPLC
  • 3.2 破菌
  • 3.2.1 破菌过程优化
  • 3.2.2 破菌结果与结论
  • 3.3 △K23 粗纯化的研究
  • 3.3.1 △K23 粗纯化方法
  • 3.3.2 △K23 粗纯化结果与结论
  • 3.4 △K23 复性
  • 3.4.1 复性方法：
  • 3.4.2 复性结果：
  • 3.5 △K23 精纯化研究
  • 3.5.1 △K23 的精纯化工艺
  • 3.5.2 △K23 的精纯化结果与结论
  • 3.6 本章小结
  • 第4章 截短型重组人角质细胞生长因子-1 聚乙二醇修饰纯化工艺研究
  • 4.1 试剂与仪器
  • 4.1.1 试剂及溶液
  • 4.1.2 仪器
  • 4.2 聚乙二醇修饰剂的筛选
  • 4.3 修饰工艺研究
  • 4.3.1 不同 pH 的对蛋白修饰率影响的研究
  • 4.3.1.1 修饰方法
  • 4.3.1.2 修饰结果与分析
  • 4.3.2 不同浓度尿素对修饰率影响的研究
  • 4.3.2.1 修饰方法
  • 4.3.2.2 结果与分析
  • 4.3.3 不同 PEG 浓度比例对修饰率的影响的研究
  • 4.3.3.1 修饰方法
  • 4.3.3.2 结果与结论
  • 4.3.4 mPEG-Mal-20K 修饰 DTT 处理的△K23 的工艺研究
  • 4.3.4.1 修饰方法
  • 4.3.4.2 结果与结论
  • 4.3.5 DTT 处理的△K23 的修饰工艺优化
  • 4.3.5.1 修饰方法
  • 4.3.5.2 结果与结论
  • 4.3.6 △K23 的修饰工艺放大研究
  • 4.3.6.1 △K23（未 DTT 处理）修饰工艺放大
  • 4.3.6.2 △K23（DTT 处理）修饰工艺放大
  • 4.3.6.3 结果与结论
  • 4.4 聚乙二醇化△K23 的纯化工艺研究
  • 4.4.1 带 4mol/L 尿素修饰的 mPEG-Mal-△K23 的纯化
  • 4.4.2 柱修饰的 mPEG-Mal-△K23 的纯化
  • 4.5 本章小结
  • 第5章 人角质细胞生长因子修饰位点确认
  • 5.1 试剂与仪器
  • 5.1.1 试剂
  • 5.1.2 仪器
  • 5.2 实验方法
  • 5.2.1 质量肽图的酶切
  • 5.2.2 LC-MS 条件研究
  • 5.3 质量肽图结果及讨论
  • 5.3.1 △K23 的质量肽图分析
  • 5.3.2 △K23 带尿素修饰的样品的质量肽图分析
  • 5.3.3 △K23 柱修饰样品的质量肽图分析
  • 5.4 本章小结
  • 第6章 聚乙二醇化重组人角质细胞生长因子体内外生物活性的研究
  • 6.1 试剂与仪器
  • 6.1.1 试剂
  • 6.1.2 仪器
  • 6.2 体外实验方法
  • 6.2.1 NBL-7 细胞测活
  • 6.2.2 实验结果
  • 6.3 大鼠 5-FU 尿嘧啶肠粘膜损伤模型体内测活
  • 6.3.1 试剂配制与样品处理
  • 6.3.1.1 供试品及配制方法
  • 6.3.1.2 阳性对照品及配制方法
  • 6.3.1.3 溶媒（阴性对照）
  • 6.3.1.4 造模用药及配制方法
  • 6.3.2 实验动物及饲养管理
  • 6.3.2.1 实验动物
  • 6.3.2.2 饲养管理
  • 6.3.3 实验方法
  • 6.3.3.1 方法
  • 6.3.4 体内实验结果
  • 6.3.4.1 观察指标
  • 6.3.4.2 结果
  • 6.4 本章小结
  • 第7章 总结及讨论
  • 致谢
  • 参考文献
  • 附录

    • 相关论文文献

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