论文摘要
【目的】分析T-reg细胞在乳腺癌病人中的表达情况及其与NK细胞、T细胞亚群之间的关系;探讨体外富集的T-reg对NK细胞杀伤乳腺癌细胞的影响;探讨NKG2D-MICA在NK细胞杀伤乳腺癌中的作用;观察T-reg对NKG2D-MICA作用的影响。【方法】1、流式细胞术检测乳腺癌患者外周血T-reg的比例;探讨乳腺癌患者TGF-β1的变化。2、应用LDH法检测NK细胞对四种乳腺癌细胞株杀伤率活性。3、ELISA检测培养上清液中IFN-γ和TGF-β1的水平4、荧光定量PCR检测四种乳腺癌细胞株MICA-mRNA的表达。5、应用流式细胞术检测四种乳腺癌细胞株表面及胞内MICA的表达;6、应用免疫组化技术和免疫荧光技术检测四种乳腺癌细胞株MICA的分布情况。7、应用FCM检测NK细胞表面的NKG2D的变化。【结果】1、乳腺癌病人T-reg的表达:乳腺癌病人和健康志愿者外周血中T-reg占CD4+T细胞总数的百分比分别是（7.5±3.0）%和（5.1±1.5）%,前者高于后者（P<0.01）。2、当NK细胞与乳腺癌细胞效靶比为10:1时,对MCF-7、MDA-MB-435s、SKBr-3和MDA-MB-231的杀伤活性分别为（40.7±3.0）%、（15.5±3.1）%、（29.7±1.8）%以及59.1±2.3)%;加入T-reg的数量为1/5的NK细胞时,杀伤活性分别降至（1.9±0.2）%、（5.7±0.4）%、（3.6±2.8）%以及（3.9±0.2）%;加入T-reg的数量为1/10的NK细胞时,杀伤活性分别降至（7.6±1.6）%、（7.3±1.0）%、（6.6±2.5）%以及（19.7±1.1）%。3、ELISA检测NK细胞分泌的IFN-γ结果显示:在无T-reg存在时,NK细胞与MCF-7、MDA-MB-435s、SKBr-3和MDA-MB-231共培养时IFN-γ浓度分别为（221.5±2.6）pg/ml、（264.4±5.5）pg/ml、（754.6±19.0）pg/ml以及（423.0±14.6）pg/ml;加入T-reg的数量为1/5的NK细胞时,IFN-γ浓度分别为（70.7±8.5）pg/ml、（14.6±0.9）pg/ml、（128.3±4.0）pg/ml以及（6.0±1.0）pg/ml;加入T-reg的数量为1/10的NK细胞时,IFN-γ浓度分别为（216.6±4.8）pg/ml、（251.7±2.2）pg/ml、（535.0±8.5）pg/ml以及（52.57±3.4）pg/ml。4、ELISA检测培养上清液中T-reg分泌的TGF-β1结果显示:在无T-reg存在时,NK细胞与MCF-7、MDA-MB-435s、SKBr-3和MDA-MB-231共培养时TGF-β1浓度分别为（13.4±0.2）pg/ml、（11.3±0.8）pg/ml、（62.9±1.3）pg/ml以及（6.2±0.5）pg/ml;加入T-reg的数量为1/5的NK细胞时,TGF-β1浓度分别为（27.2±0.3）ng/ml、（12.2±1.0）ng/ml、（77.6±1.0）ng/ml以及（9.1±0.1）ng/ml;加入T-reg的数量为1/10的NK细胞时,TGF-β1浓度分别为（46.8±1.6）ng/ml、（15.8±0.9）ng/ml、（87.8±2.3）ng/ml以及（10.9±0.6）ng/ml。5、MICA的表达与分布:（1）荧光定量PCR结果显示:MDA-MB-231、SKBr-3、MCF-7和MDA-MB-435s四种细胞株MICAmRNA相对于GAPDH的相对含量分别为5.56×10-3、2.53×10-3、1.68×10-3和5.99×10-5。（2）流式细胞术检测4种乳腺癌细胞株MICA表达,结果显示MDA-MB-231表达量为（61.5±4.5）%、MCF-7为（56.5±4.7）%,而SKBr-3和MDA-MB-435s几乎不表达MICA分子;穿孔后MDA-MB-231和MCF-7这两株细胞株MICA的表达量与穿孔前相比增加不明显,而MDA-MB-435s和SKBr-3这两株细胞株MICA的表达量分别为（26.4±2.5）%和（20.7±1.3）%。（3）免疫组化证实MDA-MB-231细胞和SKBr-3细胞MICA在细胞膜和细胞浆都有表达,MCF-7细胞MICA在细胞浆和核膜都有表达,MDA-MB-435s细胞MICA主要在细胞浆表达;免疫荧光证实MDA-MB-231细胞和SKBr-3细胞MICA在细胞膜和细胞浆都有表达,MCF-7细胞MICA主要表达在细胞膜上,MDA-MB-435s细胞MICA主要在细胞浆表达。NK对不同的乳腺癌细胞株的杀伤结果表明,乳腺癌细胞株MICA表达部位不同,NK细胞对其杀伤率不同。【结论】T-reg细胞对NK细胞杀伤乳腺癌的作用其机制可能与T-reg分泌的细胞因子TGF-β1有关。MICA在乳腺癌细胞膜上表达越多,NK细胞对该细胞的杀伤率越高。
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