心脏型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）的原核表达、纯化及其单克隆、多克隆抗体的制备与应用研究

论文摘要

通过RT-PCR扩增人心脏型脂肪酸结合蛋白H-FABP的基因片断，将目的基因与原核表达载体pET28a连接，构建原核表达重组质粒pET28a-H-FABP。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21中，通过IPTG诱导表达人心脏型脂肪酸结合蛋白。利用pET28a构建的H-FABP原核表达质粒在BL21实现了高效表达，经SDS-PAGE电泳分析显示，表达的重组蛋白分子质量约为15kD。采用离子交换层析柱纯化H-FABP重组蛋白，通过Q-HP柱（pH11.5）纯化后得到高纯度H-FABP重组蛋白，含量约为0.48mg/mL。Western blotting鉴定纯化后重组蛋白特异性结果表明，所得重组蛋白与商品化的H-FABP单抗呈特异性反应。利用B细胞表位在线预测软件，综合分析蛋白结构β-转角，蛋白抗原表面可及性，蛋白柔韧性，蛋白抗原性，疏水性及线性抗原表位，我们选择了具有较强抗原特异性的H-FABP区段作为免疫原与重组H-FABP一起免疫动物。通过改良免疫方法将H-FABP全长抗原及表位肽免疫新西兰大白兔获得兔抗人H-FABP抗血清，应用蛋白A柱将抗血清中IgG组分纯化分离出来，应用亲和层析技术将抗体中针对重组蛋白标签的抗体去除，得到高特异针对H-FABP的兔抗人多克隆抗体。通过ELISA，Western blotting等方法证实了该抗体的高效价和高特异性。使用重组H-FABP全长抗原及表位肽免疫Balb/c小鼠，应用改良的杂交瘤技术将免疫小鼠的脾细胞与Balb/c小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0在聚乙二醇作用下融合，HAT选择性培养，间接酶联免疫吸附方法对融合细胞培养上清进行筛选，选择抗H-FABP单克隆抗体阳性的细胞株采用有限稀释法连续进行亚克隆，建立稳定分泌抗H-FABP单克隆抗体的杂交瘤细胞株。采用小鼠腹腔内诱生法扩大培养阳性单克隆细胞株后，腹腔注射石蜡处理过的小鼠，制备腹水。腹水经HiTrap IgG PurificationHP亲和层析柱纯化，所得的单克隆抗体进行效价测定，亲和力测定。经筛选得到6株稳定分泌抗H-FABP单克隆抗体的杂交瘤细胞株，经亚类鉴定均为IgG型，6株单抗效价均在1：256000以上，亲和力最高可达9.02×10-9。Western blotting鉴定表明6株单克隆抗体均具有较高的特异性。成功制备的这6株抗H-FABP特异性的单克隆抗体，可应用于建立一种新型H-FABP免疫检测方法。利用实验室已制备的抗H-FABP抗体作为捕获抗体和检测抗体，以H-FABP重组蛋白作为检测抗原,进行抗体配对试验，经过优化ELISA反应条件，分别检测26例临床AMI血清及34例正常血清标本中的H-FABP，并进行结果比较分析，结果成功得到了能检测天然H-FABP的配对抗体3-H5—1-F10，并以此成功建立了检测H-FABP的双抗体夹心ELISA方法。因此，所获得的高特异性抗体3-H5—1-F10将会为今后H-FABP的检测以及新型免疫检测试剂盒的研发奠定重要的基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩写一览表
• 1 引言
• 1.1 研究目的和意义
• 1.2 本研究的主要内容
• 1.2.1 H-FABP 的高效原核表达与纯化
• 1.2.2 抗 H-FABP 多克隆抗体的制备及鉴定
• 1.2.3 抗 H-FABP 单克隆抗体的制备及鉴定
• 1.2.4 抗 H-FABP 抗体在临床标本检测中的应用研究
• 1.3 本研究的技术路线
• 2 H-FABP 的高效原核表达与纯化
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 主要材料与试剂
• 2.1.2 主要仪器与设备
• 2.1.3 主要试剂的配制
• 2.1.4 方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 确定拟克隆的基因序列和蛋白质序列
• 2.2.2 逆转录 PCR（RT-PCR）扩增人 H-FABP
• 2.2.3 重组质粒 pET28a-H-FABP 酶切鉴定
• 2.2.4 pET28a-H-FABP 小量诱导表达
• 2.2.5 大量诱导表达蛋白纯化
• 2.2.6 纯化后 H-FABP 的浓度及特异免疫反应性鉴定
• 2.2.7 纯化后 H-FABP 的 Western blotting 分析
• 2.3 讨论
• 3 抗 H-FABP 多克隆抗体的制备及鉴定
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验动物与免疫原
• 3.1.2 主要仪器与设备
• 3.1.3 主要试剂的配制
• 3.1.4 方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 兔抗人 H-FABP 多克隆抗体效价测定
• 3.2.2 Western Blotting 鉴定 H-FABP 多克隆抗体
• 3.2.3 ELISA 鉴定 H-FABP 多克隆抗体特异性
• 3.3 讨论
• 4 抗 H-FABP 单克隆抗体的制备及鉴定
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验动物、免疫原与细胞系
• 4.1.2 主要仪器
• 4.1.3 主要试剂
• 4.1.4 方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 抗 H-FABP 单克隆抗体的制备
• 4.2.2 抗 H-FABP 单克隆抗体的纯化
• 4.2.3 抗 H-FABP 单克隆抗体的鉴定
• 4.2.4 Western blotting 鉴定抗 H-FABP 单克隆抗体特异性
• 4.3 讨论
• 5 抗 H-FABP 抗体配对及其在临床标本检测中的应用研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 研究材料
• 5.1.2 主要仪器与设备
• 5.1.3 主要试剂
• 5.1.4 方法
• 5.2 结果
• 5.2.1 HRP 标记抗体及效价测定
• 5.2.2 抗体配对及条件优化
• 5.2.3 双抗体夹心 ELISA 方法的建立及临床样本检测
• 5.3 讨论
• 6 全文总结
• 7 文献综述
• 参考文献
• 作者在攻读硕士学位期间发表的论文目录、科研情况
• 致谢