白蚁肠道固氮菌的分离与鉴定及固氮酶基因的克隆与分析

论文摘要

白蚁属于典型的寡氮营养型生物,主要以富含纤维素、半纤维素和木质素的木质材料为食,但这类食物的含氮量均不高。研究表明,白蚁体内的含氮量与其它动物相似,白蚁肠道内有大量固氮微生物存在,白蚁体内60%的氮来自其后肠共生微生物的固氮作用。黑翅土白蚁（Odontotermes formosanus）是等翅目大白蚁亚科的高等培菌白蚁,是主要的农林作物和水利堤坝害虫。本试验以取自武汉洛珈山的O.formosanus为材料,以无氮培养基为分离培养基,采用平板划线分离法从O.formosanus肠道内分离出了具有高固氮酶活性的固氮菌株36株。通过形态学观察、生理生化试验和分子生物学鉴定,试验结果表明,菌株HUB-IV-004和HUB-IV-033为肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）、HUB-IV-005 为变栖克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）、菌株HUB-IV-006为产酸克雷伯氏菌（Klebsiellaoxytoca）另外,本试验以实验室自行分离保藏的树木内生菌HUB-I-004、HUB-I-032、HUB-I-034、HUB-I-047为功能菌,以本试验已分离的白蚁肠道固氮菌为指示菌,采用牛津杯法进行了抑菌试验。结果发现,树木内生菌发酵产物对白蚁肠道固氮菌有较好的抑制作用;此外,本试验将分离的白蚁肠道固氮菌株和试验室保藏的分离自白蚁体内的纤维素分解菌进行了混合培养,试验结果表明,显著提高了纤维素分解菌的纤维素酶活力,为菌株间的协同作用提供了理论依据;同时,本试验研究利用PCR技术成功克隆了nifH因的全长,并将nifH基因与表达载体pET28a连接并转化大肠杆菌BL21,在IPTG诱导下表达目的蛋白,表达纯化产物经质谱分析表明,目的蛋白为固氮酶铁蛋白,为研究白蚁的固氮机制奠定基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 1.1 白蚁概述
• 1.2 白蚁肠道微生物分离研究现状
• 1.2.1 白蚁肠道内的原生动物
• 1.2.2 白蚁肠道内的细菌
• 1.2.3 白蚁肠道内的真菌
• 1.2.4 白蚁肠道内的螺旋体
• 1.3 白蚁防治
• 1.3.1 物理防治
• 1.3.2 化学防治
• 1.3.3 生物防治
• 1.4 白蚁肠道内具有固氮作用的微生物
• 1.4.1 生物固氮原理
• 1.4.2 白蚁与固氮作用
• 1.4.3 白蚁肠道内固氮菌的研究
• 1.4.4 白蚁肠道内固氮酶的研究
• 1.5 本试验研究的目的意义及主要研究内容
• 1.5.1 目的意义
• 1.5.2 主要研究内容
• 第2章 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 白蚁及菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 主要分子生物学与生化试剂
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 白蚁肠道内固氮菌分离
• 2.2.2 白蚁肠道固氮菌固氮酶活性的测定
• 2.2.3 白蚁肠道固氮菌的分类地位鉴定
• 2.2.4 树木内生菌发酵产物对固氮菌的抑制作用
• 2.2.5 固氮菌和纤维素分解菌混合培养
• 2.2.6 固氮酶基因（nifH）的克隆与表达
• 第3章 结果与分析
• 3.1 白蚁肠道内固氮菌的分离
• 3.2 固氮菌固氮酶活性测定
• 3.3 白蚁肠道内固氮菌株的分类地位鉴定
• 3.3.1 形态学观察
• 3.3.2 生理生化鉴定
• 3.3.3 分子生物学鉴定
• 3.4 树木内生菌发酵产物对固氮菌的抑制作用
• 3.5 混合培养固氮菌对纤维素分解菌酶活的影响
• 3.5.1 葡萄糖标准曲线的绘制
• 3.5.2 纤维素酶活力的测定
• 3.6 固氮酶基因（nifH）的克隆与表达
• 3.6.1 nifH基因的克隆与序列分析
• 3.6.2 nifH基因的表达
• 第4章 讨论
• 4.1 白蚁肠道内固氮菌的分离与鉴定
• 4.1.1 白蚁肠道固氮菌的分离
• 4.1.2 白蚁肠道固氮菌的固氮酶活性检测
• 4.1.3 固氮菌的分类地位鉴定
• 4.2 树木内生菌发酵产物对固氮菌的抑制作用
• 4.3 固氮菌与纤维素分解菌混合培养对纤维素酶活的影响
• 4.4 nifH基因的克隆与表达
• 4.4.1 nifH基因的克隆
• 4.4.2 nifH基因的表达
• 第5章 结论
• 第6章 本论文的创新点
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 攻读硕士学位期间参与研究课题情况