昆明鼠乙酰胆碱酯酶克隆表达与活性测定

论文摘要

乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase,AChE,EC3.1.1.7）是生物神经传导中的一种关键酶,主要存在于神经元和神经肌肉接头处,定位于细胞膜和突触前后膜,能快速水解神经递质乙酰胆碱（Acetylcholine,Ach）生成胆碱及乙酸,终止神经递质对突触后膜的兴奋作用,保证神经信号在生物体内的正常传递。有机磷类（organic phosphorus,OPs）和氨基甲酸酯类（carbamates,CBs）农药是目前生物防治中应用最广泛的农药,这两类农药通过抑制有机体的AChE活性,使得乙酰胆碱在突触内大量积累,进而引起生物体神经传递的阻断,使得中枢神经、交感神经、运动神经和一些腺体兴奋,导致运动失调,最终动物体瘫痪甚至中毒死亡。因此,AChE作为OPs和CBs的最适反应底物,在农药残留的快速检测中得到了广泛应用。AChE的生物传感器已成为农残检测中的热点。目前应用农药残留检测的AChE主要通过生物化学方法从动物组织或血液中提取获得,这种方法得到的AChE产量低,成本高,灵敏度变幅大,成分杂,影响了AChE作为生物传感器的推广。通过分子生物学方法克隆AChE基因,构建高效表达载体表达基因,分离纯化目标蛋白并大量制备活性的蛋白具有重要的理论意义和良好的应用前景。本实验采用RT-PCR方法成功克隆到昆明鼠脑组织乙酰胆碱酯酶cDNA,序列全长1845bp,选用EcoRⅠ/SalⅠ限制性内切酶消化后将AChE基因亚克隆到pET28a原核表达系统,成功构建了含AChE基因的重组表达质粒pET-ace。将pET-ace转化EcoliBL21,在1mmol/L IPTG诱导下获得高效表达。SDS-PAGE分析表明诱导后在68kDa左右的位置出现特异的蛋白质条带,该条带大小与文献报道基本一致。实验设定了不同IPTG浓度和不同时间对含有重组质粒的E.coli进行诱导并分析蛋白的表达情况。结果表明:在0.1-1.0mmol/L的IPTG诱导范围内,蛋白表达量随IPTG浓度增加而增大;在诱导时间为2、4、6、8、10、12、20h,均有清晰的蛋白条带出现,其中6h蛋白表达量最高。经超声破碎、SDS-PAGE分析表明表达蛋白大部分以包涵体形式存在。采用改良的Ellman法于表达产物上清液中成功地检测到了AChE活性,并采用Ellman法测定了AChE的最适pH、最适温度以及不同诱导温度对AChE活性的影响。结果表明AChE的最适pH为8.0;最适温度为30℃;在15℃、20℃、25℃、30℃诱导下,蛋白上清的总活力随温度升高而升高,而比活力随温度升高而降低。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 农药残留检测的重要性及存在问题
• 1.1.1 农药残留现状
• 1.1.2 开展农药残留检测的重要性
• 1.1.3 农产品农药残留检测工作存在的问题
• 1.2 目前农药残留检测的主要方法和手段
• 1.2.1 气相色谱法（GC）
• 1.2.2 高效液相色谱法（HPLC）
• 1.2.3 色-质联用（GC-MS,HPLC-MS）
• 1.2.4 超临界流体色谱（SFC）
• 1.2.5 薄层色谱法（TLC）
• 1.2.6 毛细管电泳（CE）
• 1.2.7 免疫分析法（IA）
• 1.2.8 传感器法
• 1.2.9 速测灵法（金属离子表面皿法）
• 1.2.10 酶抑制法
• 1.3 酶抑制法检测原理及乙酰胆碱酯酶在农药残留检测中的应用
• 1.3.1 酶抑制法检测的原理及方法
• 1.3.2 乙酰胆碱酯酶在农药残留检测中的应用
• 1.4 乙酰胆碱酯酶的研究进展
• 1.4.1 乙酰胆碱酯酶的分子形式及基因分析
• 1.4.2 乙酰胆碱酯酶的晶体结构
• 1.4.3 AChE的功能位点
• 1.4.4 AChE突变对昆虫抗药性的影响
• 1.4.5 AChE分子生物学在临床医学和环境检测上中的应用
• 1.4.6 AChE的制备
• 1.5 本研究的立题依据及意义
• 2 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 组织、菌株和质粒
• 2.1.2 化学试剂及抗菌素
• 2.1.3 常用贮存液
• 2.1.4 限制性内切酶及其它工具酶
• 2.1.5 培养基
• 2.1.6 常用缓冲液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 昆明鼠脑组织RNA的提取——Trizol法
• 2.2.2 昆明鼠脑组织AChE cDNA的合成——两步法RT-PCR
• 2.2.3 DNA限制性内切酶消化
• 2.2.4 DNA片段的回收和连接
• 2.2.5 E.coli感受态细胞的制备和转化
• 2.2.6 质粒DNA的提取
• 2.2.7 互补法筛选阳性克隆
• 2.2.8 重组质粒的鉴定
• 2.2.9 蛋白质的原核表达
• 2.2.10 表达产物的SDS-PAGE分析
• 2.2.11 目的蛋白的大量制备
• 2.2.12 目的蛋白的活性测定
• 3 实验结果与分析
• 3.1 鼠脑总RNA的提取
• 3.2 RT-PCR扩增鼠脑组织AChE
• 3.3 重组克隆载体pMD-ace的构建
• 3.4 重组克隆载体pMD-ace的鉴定
• 3.5 鼠脑AChE cDNA的测序结果与分析
• 3.6 鼠脑AChE cDNA重组表达载体pET-ace的构建及鉴定
• 3.7 昆明鼠脑AChE cDNA在E.coli中的表达
• 3.8 昆明鼠脑AChE活性测定
• 4 讨论
• 参考文献
• 硕士期间发表的论文
• 致谢