白藜芦醇对大鼠肝纤维化的防治及相关机制的研究

论文摘要

肝纤维化（hepatic fibrosis,HF）是多种慢性肝病发展的共同病理基础,是肝脏纤维组织的过度沉积,其中心环节是静止期肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）的活化和向肌成纤维样细胞和成纤维细胞的转化,导致大量细胞外基质的合成,另一方而细胞外基质的降解减少导致其合成与降解的不平衡促进了肝纤维化形成。近年来的研究认为,氧化应激及活性氧在HSC活化和肝纤维化形成过程中起着重要的作用。因此,清除氧自由基、抑制脂质过氧化成为抗肝纤维化的一个重要靶点。在我国,肝纤维化、肝硬化大多数与病毒性肝炎有关,往往是由于慢性病毒性肝炎迁延变化而成的,针对慢性肝炎肝纤维化的病理特征,本文拟在以前工作的基础上,采用猪血清诱导的肝纤维化模型,从病理观察、血清生化指标等进一步阐明白藜芦醇抗肝纤维化的有效性;并拟采体外培养表型活化的肝星状细胞HSC-T6建立细胞模型,采用分子生物学方法（Real Time-PCR技术）、从细胞凋亡、H2O2诱导HSC脂质过氧化等方面对白藜芦醇抗肝纤维化的作用机理进行研究,为白藜芦醇的进一步推广与开发应用提供实验依据。1.通过对猪血清诱导的肝纤维化大鼠模型,观察白藜芦醇大鼠肝组织形态学的影响及肝组织HA、LN、C-Ⅳ、PⅢNP及HyP的影响。结果显示:（1）白藜芦醇高剂量组和中剂量组明显改善,汇管区纤维结缔组织显著减少;而模型组大鼠肝组织小叶内、小叶间有炎性细胞浸润;汇管区因纤维结缔组织增生而扩大明显。白藜芦醇可显著改善大鼠肝纤维化,预防组和治疗组中白藜芦醇干预的大鼠肝纤维化分级程度与各自模型组相比明显减轻护（P＜0.01）。（2）白藜芦醇30mg/kg、15mg/kg腹腔注射可显著降低大鼠血清ALT、AST、ALP水平,提高A/G比值（P＜0.01）。（3）白藜芦醇30gm/kg、15mg/kg腹腔注射可显著降低肝纤维化大鼠血清HA、LN、PⅢNP、C-Ⅳ水平（P＜0.01）。（4）与模型组相比,在大鼠肝纤维化形成过程中和肝纤维化形成后灌胃给药白藜芦醇30mg/kg、15mg/kg、7.5mg/kg可下调TGF-β1、TIMP-1表达（P＜0.01）。2.通过对猪血清诱导的肝纤维化大鼠模型,制备大鼠肝脏组织匀浆,分别检测过氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、羟脯氨酸（Hyp）的含量。猪血清诱导的肝纤维化模型大鼠肝组织脂质过氧化指标MDA含量升高,SOD含量下降（与正常组比较P＜0.01）,白藜芦醇大剂量和中剂量均能够降低MDA含量,升高SOD含量（与模型组比较P＜0.05,P＜0.01）;模型组大鼠肝组织Hyp含量明显升高（与正常组比较P＜0.01）,白藜芦醇大剂量组和中剂量组能够明显降低Hyp含量（与模型组比较P＜0.01,P＜0.05）。3.观察大鼠Fas/FasL、TNF-α凋亡基因mRNA的表达与白藜芦醇的干预作用。结果显示:白藜芦醇可明显上调大鼠肝组织及体外培养HSC Fas/FasL基因mRNA的表达,体内体外实验中其上调作用均优于阳性对照药。认为白藜芦醇通过调节Fas/FasL系统诱导活化的HSC凋亡,从而逆转肝纤维化。4.观察白藜芦醇对肝星状细胞（HSC-T6）抑制增殖及基质金属蛋白酶抑制因子mRNA（TIMP-1mRNA）表达的影响,探讨白藜芦醇高、中、低剂量组抗肝纤维化效果和作用。体外培养HSC-T6,随机分为4组:对照组、白藜芦醇高剂量组、中剂量组和小剂量组。加药后用MTT法检测各组HSC-T6增殖变化,且采用RT-PCR方法测定各组HSC-T6的TIMP-1mRNA的表达。结果显示:白藜芦醇各组药对HSC-T6的增殖有明显的抑制作用,且作用效果较稳定。TIMP-1mRNA表达对照组明显TIMP-1mRNA/GAPDH（0.936±0.01,P＜0.01）高于30mg组（0.646±0.007,P＜0.01）、15mg（0.765±0.02,P＜0.01）、7.5mg（0.718±0.04,P＜0.01）组。正常对照组、高剂量组、中剂量组和低剂量组相比,各药物组明显低于正常对照组。证实了白藜芦醇可通过抑制TIMP-Ⅰ的这一作用来发挥其抗肝纤维化作用,并且作用较明显。5.采用Ⅳ型胶原酶灌流法分离大鼠肝细胞进行原代培养,用H2O2体外诱导肝细胞损伤,MTT法检测细胞存活和增殖活性。实验表明,H2O2损伤导致肝酶变化,如反映肝细胞损伤的AST,ALT均明显升高。在H2O2损伤的肝细胞中加入白藜芦醇后,随白藜芦醇剂量加大,细胞培养上清中的肝酶活性进行性降低,提示白藜芦醇能减轻肝细胞损伤,减少ALT与AST的释放（P＜0.01）。在H2O2损伤的肝细胞中加入白藜芦醇后,白藜芦醇能明显降低肝细胞内的MDA含量,同时也可提高GSH的含量,提示白藜芦醇能有效对抗H2O2引起脂质过氧化作用,减少脂质过氧化物的形成。提示白藜芦醇对H2O2诱导肝细胞损伤有直接保护作用。6.用H2O2诱导HSC脂质过氧化,白藜芦醇(0.125～1mg·m-1)可明显降低培养上清液中MDA含量和Ⅰ型胶原水平,与空白对照组比较,模型组HSC增殖明显升高;与模型对照组比较,白藜芦醇各剂量组不同程度降低HSC的增殖,呈明显剂量效应关系（P＜0.01）。模型组MDA水平明显升高,而SOD活力显著降低。给予白藜芦醇后,MDA水平明显降低,SOD活力明显升高,且呈明显剂量效应关系（P＜0.01）。提示白藜芦醇对HSC的增殖及Ⅰ型胶原的介成具有抑制作用,该作用可能与其抗氧化作用有关。本文利用猪血清诱导的大鼠肝纤维化模型,从血清肝纤指标、肝脏HyP含量及肝脏组织形态改变对白藜芦醇治疗实验性肝纤维化的作用进行了评价,证实白藜芦醇对猪血清诱导的大鼠实验性肝纤维化具有明显的预防和治疗作用;其作用机制与拮抗细胞因子TGF-β1、抑制TIMP-1表达增高,从而促进胶原降解;抑制肝星状细胞活化并促进活化的肝星状细胞凋亡相关。体外实验以HSC-T6细胞作为模型,用MTT法检测了白藜芦醇对HSC-T6增殖的影响,进一步证实白藜芦醇具有抑制HSC增殖和活化的作用。从体内、体外探讨了白藜芦醇对HSC凋亡的诱导作用及其凋亡的途径,表明白藜芦醇可通过Fas/FasL系统介导的HSC凋亡发挥治疗肝纤维化的作用。体外实验以HSC--T6细胞作为研究平台,探讨白藜芦醇对H2O2诱导HSC脂质过氧化,证实白藜芦醇可能通过抑制脂质过氧化从而抑制HSC的活化、增殖和细胞外基质（ECM）的生成,起到抗肝纤维化的作用。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 文献研究
• 第一章 肝纤维化的病因与发病机制
• 1 肝纤维化概念
• 2 肝纤维化病因
• 3 发病机制
• 4 ECM与肝纤维化
• 第二章 肝纤维化的诊断与治疗
• 1 肝纤维化的诊断
• 1.1 组织病理学诊断
• 1.2 肝纤维化的血清学诊断
• 1.3 肝纤维化的影像学诊断
• 2 肝纤维化的治疗
• 2.1 肝纤维化的西医治疗研究
• 2.2 肝纤维化的中医药治疗
• 第三章 肝纤维化的动物模型研究
• 4）诱导肝纤维化模型'>1 四氯化碳（CCl₄）诱导肝纤维化模型
• 2 二甲基亚硝氨（DMN）诱导肝纤维化动物模型
• 3 异种动物血清及蛋白诱导肝纤维化动物模型
• 4 刀豆素蛋白A（ConA）诱导肝纤维化模型
• 5 乙醇诱导肝纤维化动物模型
• 6 胆管阻塞性肝纤维化模型
• 7 D-半乳糖胺诱导肝纤维化动物模型
• 8 血吸虫虫卵诱发肝纤维化模型
• 第四章 肝星状细胞凋亡与肝纤维化逆转的关系
• 1 HSC凋亡与肝纤维化逆转
• 2 HSC凋亡发生的基本途径
• 3 HSC凋亡的其他途径和影响因素
• 第五节 白藜芦醇的研究进展
• 1 保肝利肝作用
• 2 免疫调节作用
• 3 抗氧化作用
• 4 抗病原微生物作用
• 5 抗肿瘤活性
• 6 对心血管系统的影响
• 7 镇咳平喘作用
• 8 降血脂作用
• 第六章 虎杖中白藜芦醇应用于抗乙型肝炎的思路
• 第二部分 实验部分
• 第一章 白藜芦醇对大鼠肝纤维化的预防和治疗作用及相关机制的实验研究
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 第二章 白藜芦醇对肝纤维化大鼠肝脏组织SOD、MDA、Hyp含量的影响
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第三章 白藜芦醇对肝纤维化大鼠Fas/FasL、TNF-α mRNA表达的干预作用
• 1 实验目的
• 2 实验材料
• 3 实验方法
• 4 实验结果
• 5 讨论
• 第四章 白藜芦醇对HSC-T6细胞增殖的影响及TIMP-1mRNA表达
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 2O₂诱导大鼠原代肝细胞损伤的保护作用'>第五章 白藜芦醇对H₂O₂诱导大鼠原代肝细胞损伤的保护作用
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第六章 白藜芦醇对肝星状细胞氧应激脂质过氧化作用的影响
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 全文小结
• 结论与展望
• 参考文献
• 英文缩略词注解
• 致谢