论文摘要
乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒（Hepatitis B virus, HBV）引起的一种广泛流行的传染病,主要经血液传播。在我国法定规定的传染病中,乙肝的发病数和发病率多年来一直高居前列,给个人、家庭以及社会造成沉重的负担。目前,依靠核酸扩增技术（Nucleic Acid Amplification Test, NAT）对血液病毒进行筛查已经在各国广泛开展。实时荧光定量PCR（Quantitative Real-Time PCR, qPCR）作为其中的代表由于需要较高的技术要求,许多单位尚不能开展。且存在荧光探针、仪器价格昂贵以及难以实现快速检测等问题。此外NAT检测过程中产生的假阴性也一直困扰着众多科研人员。胶体金免疫层析（Gold Immunochromagraphy Assay, GICA）法是20世纪80年代末发展起来的一种快速的免疫学测定方法,它是胶体金标记技术和免疫层析技术相结合的产物。其基本原理是利用微孔滤膜的渗滤浓缩和毛细管作用,使抗原抗体反应在固相膜上快速进行。当待测物质存在时,胶体金会停留在相应位置呈现红色,阴性反应则不形成红色,GICA全过程只需10 min左右。我们结合聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）与GICA的优点建立了核酸试纸条方法（Nucleic acid dipstick assay, NADA）,并将其应用于乙型肝炎病毒的检测中。该方法利用PCR扩增乙肝病毒的保守区,其中上、下游引物的5’端分别修饰异硫氰酸荧光素和生物素。核酸试纸条上的胶体金以及检测线处分别标记有链霉亲和素以及抗荧光素抗体。将扩增产物与展开液混合后点样,10 min后即可用肉眼判读结果。对各种条件优化后证明NADA检测乙肝病毒核酸的灵敏度为250 copies/mL。对15例阴性样本及33例HBsAg阳性样本的检测结果也表明,该方法与实时荧光定量PCR的特异性均为100%。且两种方法检测不同血清标志物类型的阳性检出率无差异。在此基础上,我们进一步研究了内控核酸试纸条法（NADA with internal control）,用来避免NAT检测过程中假阴性的产生。该方法的关键即在待提取的血清样本中加入制备好的内控,接着单管二重扩增含有目的核酸片段和内控核酸片段的提取液。另一方面,我们又在传统免疫层析试纸条上增加了一条内控检测带,从而可以同时检测上述两种扩增产物。由于内控始终与待测病原体平行提取、扩增和检测,从而实现了对目的片段检测的全程监控,使检测结果更为准确、可靠。研究表明,我们制备的内控试纸条以及病毒核酸相应内控具有很好的特异性。在血清样本中加入105 copies的内控,即能对103 copies/mL及其以上的浓度的样本进行全程监控,减少假阴性产生的可能性。核酸试纸条技术能够用于病原体的可视化检测,初步的临床应用结果证明,该方法灵敏度高,特异性好,操作简单快速,加入内控后能防止假阴性的产生。本方法的建立为乙肝病毒的流行病学调查及基层医院体检奠定了一定的基础。