副粘病毒Tianjin株NP基因的表达及在儿童下呼吸道感染检测中的应用

论文摘要

1999年从呼吸道感染导致死亡的灵长类动物普通棉耳狨猴肺组织中分离到一株病毒,该毒株与普通棉耳狨猴下呼吸道感染之间符合科赫原则。分离株经电镜观察,具有典型的副粘病毒特征;交叉血凝抑制试验、RT-PCR扩增HN基因并测序、生物信息学方法进行核酸序列的联配检索和系统进化分析,表明该毒株与仙台病毒（SeV）的同源性较高,但推导出的氨基酸序列仍存在较大的差异,暂时命名为副粘病毒Tianjn株。进一步的血清学调查结果显示,动物中心工作人员都含有此病毒的抗体;正常人群（献血员）中对此病毒的抗体阳性率高达46.7%;患急性呼吸道感染的儿童抗体阳性率为30～37%,说明此病毒与人类关系密切。更重要的是,SeV是啮齿类动物致死性病原体,而在普通棉耳狨猴呼吸道疾病流行期间,饲养在同一实验中心的各种实验用鼠无一例发病。因而可能是SeV发生了某些变异而跨越了种属界限,形成对啮齿类动物致病性低,对灵长类动物乃至人类致病性高的毒株。目前,我们已经完成了对该株病毒的全基因组测序（Genbank accession number:EF679198）,全基因组序列的系统进化分析,也说明与SeV同源性较高,证明了该株病毒为SeV的一个新基因型。为了进一步在分子水平上了解其蛋白结构与功能的关系,探讨致病机制,建立简便、快速、特异的检测方法,本研究根据全基因组序列,设计合成了三对引物,分三段扩增了副粘病毒Tianjin株的核衣壳蛋白（nucleocapsid protein,NP）基因,将扩增片段与质粒pET28a连接,分别构建了原核表达质粒pET28a-NP1、pET28a-NP2和pET28a-NP3。经诱导表达和纯化,获得了重组蛋白NP1、NP2和NP3。以超速离心纯化的病毒和纯化的重组蛋白分别免疫兔子和小鼠,制备了多克隆抗体（PcAb）;ELISA、dot blot和western blot方法检测了重组蛋白NP1、NP2和NP3的免疫反应性;分别以重组蛋白NP1、NP2和NP3为抗原,间接ELISA法检测了186例下呼吸道感染患儿血清中的IgG、IgM,并与全病毒抗原ELISA法进行了比较。制备了重组蛋白的单克隆抗体（McAb）,对McAb的抗原识别位点、稳定性、特异性作了初步分析。结果表明:（1）重组蛋白NP1、NP2和NP3能与副粘病毒Tianjin株兔多克隆抗血清特异反应,具有天然抗原性,而且抗原性强弱明显不同,NP3最强,其余依次为NP1和NP2。（2）重组蛋白NP1、NP2和NP3的PcAb与常见呼吸道病原体,如甲、乙型流感病毒,肺炎支原体,甲型流感病毒鼠肺适应株（FM1株）无明显反应性;NP1和NP3抗血清与副流感病毒Ⅰ、Ⅲ型,NDV呈阳性反应,NP2抗血清仅与副流感病毒Ⅲ型呈阳性反应;而副粘病毒Tianjin株鼠多克隆抗血清与除肺炎支原体以外的上述病原体均有交叉反应。由于重组蛋白比全病毒抗原易获得、更安全、有利于提高特异性和敏感性,以重组蛋白NP1、NP2和NP3为抗原检测抗体,比全病毒抗原更有优势。（3）全病毒抗原ELISA法检测186例患儿血清标本IgG、IgM的阳性率分别是30.65%和19.89%;重组蛋白NP1、NP2和NP3为抗原,IgG阳性率分别为24.19%、22.04%、20.97%;IgM阳性率分别为18.82%、16.67%、15.60%。重组蛋白ELISA法比全病毒抗原ELISA法有特异性更好的趋势。（4）获得了一株稳定分泌NP2 McAb的细胞株G1B9D5。该细胞株培养上清液与NP1和NP3不结合,说明这株McAb的抗原识别位点在NP蛋白aa202-aa324范围内。McAb G1B9D5与常见下呼吸道感染病原体没有交叉反应,特异性好。为进一步研究病毒蛋白结构与功能的关系及致病机制,建立快速、敏感、特异的检测副粘病毒Tianjin株的方法奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 一、副粘病毒Tiarajin株NP基因的克隆表达与分析
• 材料与方法
• 结果
• 二、重组蛋白NP在副粘病毒Tianjin株引起儿童下呼吸道感染临床调查中的应用
• 材料与方法
• 结果
• 三、重组蛋白NP1、NP2和NP3单克隆抗体的制备及初步分析
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 附录
• 综述
• 真核表达系统的研究进展
• 综述参考文献
• 致谢