论文题目: 苹果醇酰基转移酶基因MdAAT2参与酯类香气合成调控机理的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 果树学
作者: 李大鹏
导师: 李德全,束怀瑞
关键词: 苹果,香气,酯类,醇酰基转移酶,基因表达,功能分析
文献来源: 山东农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 苹果(Malus domestica Borkh.)是世界上最重要的鲜食和加工果品之一。香气作为苹果品质的重要指标在一定程度上影响了消费者的购买欲望。挥发性酯类物质是构成成熟苹果特征香气最重要的成分之一。为了研究苹果酯类合成与调控机制,我们从金冠苹果中分离出酯类合成途径最末端的关键酶-醇酰基转移酶基因(MdAAT2),并对它的表达模式和调控机制进行了深入研究。主要结果如下:1、苹果酯类挥发性成分提取与分析对比了三种不同类型的SPME纤维头提取苹果酯类物质的效果。结果发现,PDMS/DVB 65μm Bonded SPME纤维头较适合苹果酯类挥发性成分的萃取,优化萃取条件为:50℃萃取30分钟。SPME-GCMS分析发现:丁酸己酯、乙酸己酯、乙酸丁酯、2-甲基丁酸己酯和己酸己酯是采后成熟金冠苹果中较重要的酯类物质。2、MdAAT2基因分离及其特征利用同源序列设计简并引物,通过RT-PCR和RACE-PCR技术分离了乔纳金苹果和金冠苹果果实中的醇酰基转移酶基因,分别命名为MdAAT1和MdAAT2。其全长分别为:1,639bp和1,628bp,二者在氨基酸水平上的同源性为94.26%,GenBank注册号分别为AY512893和AY517491。序列分析表明,MdAAT2大部分氨基酸区域为亲水结构,其中含有2个推测的跨膜区,分别在148aa和174aa。序列比对发现MdAAT2也含有BAHD基因家族和其它已知醇酰基转移酶基因共有的氨基酸保守区:HXXXD和FGWG。聚类分析发现,MdAAT2蛋白与同属蔷薇科仁果类的梨果实醇酰基转移酶蛋白亲缘关系最近,而与柠檬、草莓、玫瑰花等醇酰基转移酶蛋白亲缘关系较远。结果表明,我们已经分离到苹果醇酰基转移酶基因。3、MdAAT2基因在E.coli中的表达将MdAAT2基因编码区克隆到原核表达载体pET32a-c(+)在Origami B(DE3)中表达了部分可溶的融合蛋白,酶活检测发现重组表达载体菌株醇酰基转移酶活性显著高于对照,表明MdAAT2基因参与了苹果酯类物质合成。4、MdAAT2基因的表达分析RT-PCR发现MdAAT2在金冠果实中特异表达,在红星果实和花中特异表达,表明MdAAT2在不同器官的表达特性有品种间差异。免疫荧光原位杂交和Western blot
论文目录:
中文摘要
英文摘要
英文缩略表
1. 前言
1.1 苹果香气成分
1.2 挥发性物质的提取技术
1.3 影响苹果香气成分的因素
1.3.1 采前因素的影响
1.3.2 采后因素的影响
1.4 苹果酯类香气成分代谢途径及相关酶
1.4.1 直链酯类香气成分代谢途径
1.4.2 支链酯类香气成分代谢途径
1.4.3 苹果酯类香气成分合成相关酶
1.5 醇酰基转移酶参与酯类挥发性成分合成的研究进展
1.5.1 花和果实中的醇酰基转移酶基因
1.5.2 花和果实中的醇酰基转移酶基因的调控
1.6 植物挥发性成分的代谢基因工程
1.7 本研究的目的与意义
2. 材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 菌株与质粒
2.1.3 酶及生化试剂
2.1.4 PCR 引物
2.1.5 培养基
2.2 实验方法
2.2.1 植物材料总 RNA 的提取
2.2.2 反转录cDNA 第一链的合成
2.2.3 cDNA 纯化（用于5′RACE）
2.2.4 对cDNA 进行末端加尾（用于5′RACE）
2.2.5 PCR 扩增
2.2.6 连接反应
2.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
2.2.8 碱法小量质粒 DNA 的提取
2.2.9 DNA 序列测定
2.2.10 苹果醇酰基转移酶cDNA克隆
2.2.11 Northern 杂交分析
2.2.12 基因组DNA 提取
2.2.13 原核表达苹果醇酰基转移酶MdAAT2 蛋白
2.2.14 原核表达苹果醇酰基转移酶MdAAT2 蛋白抗体制备及效价测定
2.2.15 Western blot 检测蛋白表达
2.2.16 蛋白质免疫荧光原位杂交
2.2.17 MdAAT2 基因转烟草正义表达载体的构建
2.2.18 MdAAT2 基因转番茄正义果实特异表达载体的构建
2.2.19 根癌农杆菌LBA4404感受态细胞的制备与转化
2.2.20 农杆菌介导的烟草的转化
2.2.21 农杆菌介导的番茄的转化
2.2.22 转基因植株的检测
2.2.23 挥发性成分测定
2.2.24 乙烯释放速率测定
2.2.25 脂氧合酶（LOX）活性测定
2.2.26 丙酮酸脱羧酶（PDC）和醛脱氢酶（ADH）活性测定
2.2.27 醇酰基转移酶（AAT）活性测定
2.2.28 组织圆片试验
2.2.29 蚜虫选择试验
2.2.30 本研究使用的软件
2.3 材料处理方法
2.3.1 采后苹果果实1-MCP 处理
2.3.2 不同信号物质处理冷藏后的苹果果实
3. 结果与分析
3.1 苹果挥发性成分分析
3.1.1 SPME 提取苹果挥发性成分分析条件的确定
3.1.2 采后成熟金帅苹果挥发性成分分析
3.2 苹果醇酰基转移酶基因(MdAAT)的分离
3.2.1 MdAAT 中间片段的分离
3.2.2 MdAAT 5’片段的分离（以MdAAT2 为例）
3.2.3 MdAAT 3’片段的分离（以MdAAT2 为例）
3.2.4 MdAAT 全长cDNA 的分离（以MdAAT2 为例）
3.3 苹果醇酰基转移酶基因(MdAAT)的序列分析
3.4 MdAAT2 在大肠杆菌中的表达、抗体制备及效价测定
3.4.1 原核表达载体的构建
3.4.2 重组蛋白表达与SDS-PAGE 分析
3.4.3 pET30a-MdAAT 重组蛋白亲和纯化及抗血清效价测定
3.5 MdAAT2 重组蛋白功能鉴定
3.5.1 可溶性MdAAT2 重组蛋白的鉴定
3.5.2 重组蛋白酶活鉴定
3.6 MdAAT2 的表达特性及挥发性酯类成分分析
3.6.1 MdAAT2 组织器官表达特性
3.6.2 MdAAT2在果实发育和成熟期间的表达特性
3.7 苹果贮后酯类挥发性成分的恢复及调控机制
3.7.1 SA，ETH和MeJA对内部乙烯（IEC）和酯类挥发性成分合成的影响
3.7.2 SA，ETH 和MeJA 对MdAAT2 表达及酶活性的影响
3.7.3 SA，ETH 和MeJA 对乙烯合成和信号转导相关基因表达的影响
3.7.4 SA，ETH 和MeJA 对酯类代谢途径相关酶活性的影响
3.8 MdAAT2 基因在烟草中超表达对烟草挥发性成分代谢的影响
3.8.1 转基因烟草表达载体P81121-MdAAT2 的构建及转基因烟草鉴定
3.8.2 转基因烟草挥发性成分分析
3.8.3 转基因烟草对蚜虫取食行为的影响
3.9 MdAAT2 基因在番茄果实特异表达对番茄果实香气成分的影响
3.9.1 筛选适合转化的番茄自交系品种
3.9.2 番茄果实特异表达载体p81121-TE8MdAAT2 的构建
3.9.3 转基因番茄果实挥发性成分分析
4. 讨论
4.1 苹果酯类挥发性成分的提取与检测
4.1.1 苹果酯类挥发性成分提取条件的选择
4.1.2 苹果酯类挥发性成分分析
4.2 MdAAT2 基因属于植物酰基转移酶BAHD 家族
4.3 MdAAT2 基因参与了苹果果实酯类挥发性成分的合成
4.4 SA，ETH 和MeJA 对贮后酯类挥发性成分恢复的调控机制
4.5 烟草和番茄酯类代谢工程
5. 结论
参考文献
附录
致谢
攻读学位期间发表论文情况
发布时间: 2006-11-03
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