白粉菌诱导的华东葡萄消减文库构建及其EST序列分析

论文摘要

葡萄白粉病Uncinula necator起源于北美洲,是严重影响全世界葡萄生产的一种葡萄白粉病。育种实践证明,培育抗病品种是控制葡萄白粉病经济有效的途径。为了更好地了解葡萄抗白粉病的抗病机制并确认抗病基因,我们用高抗白粉病的华东葡萄株系“白河-35-1”,经病叶压片法人工接种白粉病菌,接种当天采集未感染病菌的叶片为Driver,接种后1-7天采集的叶片为Tester,构建了抗白粉病的消减文库。本实验以构建的消减cDNA文库为基础,以测序为主线,结合生物信息学方法对获得的序列进行分析,以期获得抗病相关基因。主要取得的结果如下:通过测序从文库中获得质量好的EST序列58个,大约130-800bp,在GenBank经BlastN和BlantX比对,有60%的EST与已知序列表现高度同源性,分别参与胁迫反应、细胞解毒、信号转导、防卫反应等。14条序列与功能未知基因同源性很高,可能是新的抗病序列。在已知功能的基因中,包括1)已确定的防卫基因:β-1,3-葡萄糖苷酶、查尔酮合酶、SAGs、富含脯氨酸蛋白;2)具有清除活性氧和解毒功能:谷胱氨肽-S-转移酶、异柠檬酸脱氢酶（NADP+）、金属硫蛋白;3)植物体受不良环境影响,具有保护细胞功能:细胞壁松弛蛋白、XTHs、Dnaj-like蛋白、泛素、BADH;4)各种胁迫条件下,维持细胞内正常代谢:果糖-1,6-二磷酸醛缩酶、1,5-二磷酸核酮糖羧化酶、果糖二磷酸醛缩酶、ATP合酶、乙酰辅酶A脱氢酶、脂酰辅酶A脱氢酶;5)参与信号转导:组蛋白去乙酰酶、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、CHD3、CDC-like激酶3。它们可能在不同的生理反应中直接或间接参与白粉病的抗性表现,但这需要进一步实验研究证实。43条高质量的EST序列,已登录GenBank数据库,登录号为:FE968989,FE968990,FE968991,FE968992,FE968993,FE968994,FE968995,FE968996,FE968997,FE968998,FE968999,FE969000,FE969001,FE969002,FE969003,FE969004,FE969005,FE969006,FE969007,FE969008,FE969009,FE969010,FE969011,FE969012,FE969013,FE969014,FE969015,FE969016,FE969017,FE969018,FE969019,FE969020,FE969021,FE969022,FE969023,FE969024,FE969025,FE969026,FE969027,FE969028,FE969029,FE969030,FE969031。本研究获得的EST序列丰富了与抗白粉病相关的基因和蛋白,并进一步证实了白粉菌侵染植物体后,β-1,3-葡萄糖苷酶、查尔酮合酶、SAGs、富含脯氨酸蛋白等防卫基因被诱导表达,为研究葡萄抗白粉病的抗病机制、发现抗病基因和抗病育种提供了重要依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 植物抗病性
• 1.1.1 植物抗病性机制
• 1.1.2 防卫反应类型
• 1.1.3 植物的防卫基因
• 1.1.4 植物的抗病基因
• 1.2 葡萄白粉病
• 1.2.1 葡萄白粉病的起源和分布
• 1.2.2 葡萄属植物对白粉病的抗性
• 1.2.3 葡萄白粉病分子生物学研究进展
• 1.3 抑制性消减杂交（SUPPRESSION SUBTRACTIVE HYBRIDIZATION, SSH）
• 1.3.1 抑制性消减杂交的原理
• 1.3.2 抑制性消减杂交研究进展
• 第二章 材料与试验方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 田间人工接种葡萄白粉病菌诱导发病
• 2.2.2 叶片采集
• 2.2.3 葡萄材料总 RNA 提取
• 2.2.4 mRNA 的分离
• 2.2.5 抑制消减杂交
• 2.2.6 二次PCR 产物纯化回收
• 2.2.7 PCR 产物的连接
• 2.2.8 连接产物的转化
• 2.2.9 蓝白斑筛选与鉴定
• 2.2.10 cDNA 片段测序及序列分析
• 第三章 结果与分析
• 3.1 消减文库构建样品总RNA 及MRNA 质量检测结果
• 3.2 RSA I 酶切与分析
• 3.3 巢式PCR
• 3.4 消减效率检测结果
• 3.5 PCR 产物的连接
• 3.6 消减文库转化后的菌液PCR 电泳结果
• 3.7 测序结果
• 第四章 讨论
• 4.1 清除活性氧和解毒功能
• 4.1.1 谷胱氨肽-S-转移酶（GSTs）
• 4.1.2 异柠檬酸脱氢酶（IDH）
• 4.1.3 金属硫蛋白（MT）
• 4.2 防卫反应
• 4.2.1 查尔酮合酶（chalcone synthase, CHS）
• 4.2.2 β-1，3 葡聚糖酶
• 4.2.3 ATP 合酶（ATP synthases）
• 4.2.4 衰老相关基因（senescence-associated genes, SAGs）
• 4.2.5 富含脯氨酸蛋白（proline-rich proteins, PRPs）
• 4.3 胁迫反应
• 4.3.1 甜菜碱醛脱氢酶（BADH）
• 4.3.2 细胞壁松弛蛋白（expansin）
• 4.3.3 DnaJ-like 蛋白
• 4.3.4 XTHs （ xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase）
• 4.3.5 果糖1,6-二磷酸醛缩酶（Fructose-1 , 6-bisphosphate aldolase，DsALDP）和核酮糖1，5-二磷酸羧化酶（ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase，Rubisco ）
• 4.3.6 泛素连接酶2
• 4.4 信号转导
• 4.4.1 丝氨酸/苏氨酸（Ser/Thr）蛋白激酶
• 4.4.2 CHD3 和组蛋白去乙酰酶
• 4.5 其它
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介