论文摘要
发光菌是指在正常生理状态下能自然发光的细菌,通常生境为海洋,多共生于海鱼体表。发光菌对环境中的毒物反应灵敏,表现在接触毒物后发光强度能迅速受到抑制。应用发光菌对物质急性毒性测试的研究在国外开始于80年代中后期。我国1995年环保局颁布了我国水质急性毒性发光菌检测方法,国际标准化组织1998年制定了发光菌水质毒性检测标准;二者都使用海水中的费希尔弧菌（Vibrio fischeri）。因海洋发光菌生境中NaCl浓度较高,用于检测淡水水质急性毒性时需要添加2%的NaCl,国外研究发现这对毒物毒性会造成干扰。我国特有的淡水发光菌青海弧菌Q67（Vibrio qinghaiensis sp. Q67）,对NaCl要求不高,适宜对淡水环境中毒物毒性进行检测,近年受到广泛关注;但与之相配的方法尚不统一,多采用细菌冻干粉复苏发光后直接检测水质毒性;而采用细菌冻干粉复苏途径存在以下问题:一是冻干粉制作成本较高,二是复苏率差异会影响检测结果,三是不能在常温下携运。以上特点限制了其推广应用。为保障野外环境条件下的水质安全,本研究从淡水发光菌生长发光规律着手,采用新鲜培养的发光菌,结合现代的光电检测仪器,对水中重金属毒物（砷、铬、铅、镉、汞）和微囊藻水样的急性毒性进行了研究,以期为常温下野外环境中的发光菌水质急性毒性检测应用打下一定基础。本研究第一部分对青海弧菌Q67的生理发光条件进行研究,拟确定最佳发光状态和菌密度,建立检测体系;为应用青海弧菌Q67对水质急性毒性检测提供基础条件。第二部分重点探索单一毒物对青海弧菌Q67的急性毒性效应,对单一毒物毒性大小,毒性作用规律进行研究。第三部分在第二部分基础上研究二元毒物联合毒性作用特点。第四部分为在实践中验证该检测体系,应用青海弧菌Q67对某库区回水区微囊藻水样的急性毒性进行检测。第五部分为给野外环境中简单设备条件下的毒性检测应用提供基础,探索青海弧菌Q67菌液在平皿中较大氧接触面生长至一定密度后的毒性检测。各部分结果如下:一、应用青海弧菌Q67对水质急性毒性检测的基础条件研究本部分研究通过比较不同pH值、水温、菌浓度、菌液生长密度（以OD600值计）下的发光值以找出最佳发光条件,并以PbCl2水溶液为代表进行初步毒性效应检测。结果显示:（一）最适pH范围为6～10,以pH 7.0最佳。（二）温度在15～30℃对Q67菌发光自然变化无影响,以25℃最佳。（三） Q67菌液的生长密度在OD600值1.7～1.8间为最佳生理发光状态,但离心浓缩提高菌浓度并不能使菌液发光成比例上升。（四） OD600值1.75的Q67生长发光菌液以蒸馏水作对照,与PbCl2毒性效应关系良好。通过本部分研究,建立了毒性测试体系:以蒸馏水作对照,测试菌液（OD600值1.71.8）与样本溶液体积比1:10,总体积550ul,pH值7.0,温度25℃,用于进一步的毒性效应检测研究。二、水中单一重金属毒物对青海弧菌Q67的急性毒性效应为探索常温（25℃）下水中砷、铬、铅、镉、汞对青海弧菌Q67的急性毒性效应,选取OD600值1.75最佳发光状态菌液以RS9901生物发光光度计为测试设备,按照第一部分研究建立的测试体系,测定水中砷、铬、铅、镉、汞对发光菌半数发光抑制效应浓度（EC50）。并对铬、铅的不同作用时间的毒性效应数据进行了分析。结果如下:（一）获得5种毒物的EC50,按毒性由小到大顺序为: As（Ⅲ）（EC50 10.76 mg/L）<Cr（Ⅵ）（EC50 7.22mg/L） < Pb（Ⅱ）（ EC505.42mg/L） < Cd（Ⅱ） （EC501.84 mg/L） <Hg（Ⅱ）（EC501.45 mg /L）,从EC50分析,砷、铬、铅、镉4种毒物对青海弧菌Q67毒性效应明显。根据文献报道数据,与基于V.fischeri发光菌国际标准的Microtox系统冻干粉复苏检测的毒性顺序基本一致;且砷、铬、镉毒性效应检测较Microtox系统敏感（Microtox,15min EC50分别为43.6、18.0、20.0mg/L）。（二）毒物Pb（Ⅱ）、Cd（Ⅱ）的EC50随作用时间延长呈现指数曲线下降的规律,毒性均呈增大趋势,其方程为:PbCl2 EC50（mg/L）=28.344e-0.0966T （R2=0.98, P<0.0001）;CdCl2 EC50（mg/L）=12.028e-0.1298T（R2=0.95,P<0.0001）。该规律为进一步深入研究单一毒物对发光细菌的毒性作用特点,应用该菌区分毒物提供了线索。（三）对PbCl2和CdCl2的毒性效应（Gamma）、作用浓度（C）、作用时间（T）进行多元回归拟合分析,建立了PbCl2和CdCl2的毒性效应方程,分别为:PbCl2:ln Gamma= -3.4095+1.0228ln C+0.0938T （R2=0.94 , P<0.0001） ; CdCl2 : ln Gamma= -3.3301+1.430ln C+0.1692 T （R2=0.98 ,P<0.0001）。根据所得方程可以对以上毒物不同浓度不同时间作用下的毒性效应进行预测,对评价毒物整体毒性效应具有较重要意义。三、水中二元联合重金属毒物对青海弧菌Q67的急性毒性效应考虑到现实中可能存在的多种毒物并存情况,在第二部分研究的基础上,本部分以等毒性浓度比例混合毒物,研究铅镉、铅铬、铅砷、砷汞,铅汞的联合毒性作用。结果:铅镉、铅铬间存有轻度拮抗效应;铅砷、砷汞间存在较大拮抗效应;铅汞间具有加和作用。提示:多种毒物存在的情况下,即使发光受抑程度较低,水中也可能含有较高浓度的毒物;在野外自然环境中一般上述情况较少,但应用时应当将当地水环境受工业污染状况纳入考量。四、某库区回水区微囊藻水样对青海弧菌Q67的急性毒性效应微囊藻毒素是由蓝藻水华中微囊藻细胞内产生,在细胞死亡后释放的一种生物毒素。本部分研究通过对某库区回水区微囊藻水样反复冻融处理破坏藻细胞,获得藻毒素的浓缩液后,应用本研究建立的毒性测试体系首次对自然界藻毒素水样的发光菌急性毒性进行检测。结果:（一）用该发光菌毒性测试体系分析自然水体水样获得较好的浓度效应关系,说明该检测体系也可用于藻毒素水样的毒性检测。（二）回水区水体15min作用的EC50（ EC50,15min）的百分比浓度为134%。（三）参照Bulich生物发光毒性效应分级标准:EC50百分比浓度>100%属无毒,76%～100%属微毒,本结果提示:微囊藻继续繁殖至密度为原水体的1.34倍时,EC50,15min=100%,达微毒级别;1.34倍微囊藻密度可作为预警线,微囊藻大于此密度必须及时对水体采取相关净化措施以保护生态环境。五、平皿培养法用于Q67菌液生长发光及相关毒物毒性检测研究由于以往培养Q67菌是采用三角烧瓶,恒温20℃、180rpm振荡培养箱中培养,但恒温振荡培养箱不便于野外携带。有文献报道菌液发光与充氧量关系密切,受此启发,利用平皿加少量培养基形成薄层表面,增大菌液与氧的接触面积,期望能生长到可用于发光毒性检测的密度;为野外环境中有限设备条件下的毒性检测应用提供基础。采用0.5mm直径镍丝制成的内径2mm接种环取1环Q67斜面菌种,加入灭菌平皿（9cm直径）中2～3mm厚（约10ml）的Q67液体培养基中,常温下自然生长至发光状态后用于金属毒物毒性检测。结果表明:菌液经21.5h达到最佳发光状态（OD600值1.82）;并成功测定了CrO3、PbCl2和CdCl2的EC50,15min值,分别为9.67、4.64和2.63mg/L,与第二部分20℃恒温振荡培养获取的最佳发光状态菌液的常温下检测数据（分别为7.22、5.42和1.84mg/L）基本一致。说明平皿培养法适宜在野外环境中简易设备条件下最佳发光状态菌液的制备及应用于金属类毒物毒性效应的检测。全文结论:一、本研究确立了新鲜培养Q67发光菌液用于毒性检测的体系:使用本研究确立的最佳发光状态菌液（OD600为1.7～1.8）;菌液与样本溶液体积比1:10,总体积550ul;pH值7.0,温度为常温（25℃）,用于检测重金属化学毒物毒性和自然水体中的微囊藻毒素毒性效果较好。研究从菌液生长的密度出发,确立的菌液最佳发光状态OD600值较容易控制;这与以往单纯基于一定发光强度范围（200～600万光子单位）的菌液测试基础条件相比更加精确,且有较好的通用性,为新鲜培养Q67发光菌液检测水质急性毒性标准化奠定了一定基础,避免了使用冻干粉带来的困扰。二、本研究发现的单一金属毒物EC50随作用时间延长呈指数曲线下降的规律对应用该菌区分单一毒物提供了线索;建立的单一金属毒物毒性效应回归模型方程在预测样本毒性大小时具有较重要的意义;发现的二元金属毒物联合作用特点提示重金属毒性检测中应考量多种毒物混杂的情况;对微囊藻毒素水样毒性研究获得较好的浓度效应关系反映应用该体系检测生物毒素效果较好;创造性的利用氧接触面较大的青海弧菌Q67平皿菌液自然生长发光状态进行毒性检测,获得较好的实验结果,简化了发光细菌毒性检测应用的平台,有利于在野外环境下的开展发光细菌水质急性毒性检测。三、水中可能存在的毒物还有很多,由于有毒试剂的购买中有限制,本研究只选取了具有代表性的几类。对同一有毒金属元素的不同化学物未进行毒性比较研究。下一步研究应扩大有毒物质的种类,使研究结果更全面。平皿菌液生长发光用于检测毒物毒性结果启示,在较大氧接触面积下培养细菌的同时,如进一步结合小型化、微量、恒化培养条件,有望能较大促进野外作业条件下的发光菌毒性检测应用。