胰岛素样生长因子-1对多发性骨髓瘤细胞RPMI8226作用的初步探讨

论文摘要

目的:多发性骨髓瘤（Multiple myeloma,MM）是以骨髓中恶性浆细胞增生并伴有广泛溶骨病变为特征的B淋巴细胞系的恶性肿瘤,大约占人体恶性肿瘤的1%-2%。尽管大剂量化疗联合造血干细胞移植已应用于MM,但其仍难以治愈。近年来,细胞因子在MM的发生发展中的作用已广为重视,业已证实,IL-6是骨髓瘤细胞生长和存活的重要细胞因子,做为本病的另一细胞因子—胰岛素样生长因子-1（IGF-1）研究还很少,本研究通过观察IGF-1对骨髓瘤细胞RPMI8226的增殖、凋亡、黏附和侵袭的影响,旨在探讨IGF-1在MM细胞生长及存活中的作用,为MM的靶向治疗提供新的思路。方法:1.细胞培养和传代人类多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226,培养于含体积分数为10%灭活胎牛血清（FBS）、100U/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素的RPMI1640培养液中。置于37℃、5%CO2的培养箱中培养,每48-72小时传代一次,实验采用对数生长期细胞,台盼蓝染色拒染率均在95%以上。2.人骨髓基质细胞的培养从健康志愿者髂前上棘后1厘米处骨穿抽取1毫升的骨髓液,将骨髓液进行全骨髓培养,用含10% FBS、100U/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素的LG-DMEM培养液,置于37℃、5%CO2的培养箱中培养,不同时间点弃悬浮细胞,用PBS尽量轻轻洗去未贴壁的细胞,加入含10% FBS的LG-DMEM培养液,对于贴壁细胞进行传代培养。3.MTT法检测IGF-1对RPMI8226细胞生长的影响取对数生长期的RPMI8226细胞悬液,以不同终浓度的IGF-1处理不同时间,培养结束前4小时每孔加入20μl MTT（5mg/ml）溶液,离心培养板,小心吸去上清,每孔加入150μl二甲基亚砜（DMSO）,振荡器充分振荡后于酶标仪570nm处测各孔吸光度值。4.流式细胞术检测IGF-1对RPMI8226细胞细胞周期及凋亡的影响取对数生长期的RPMI 8226细胞1×10 6个,以不同浓度IGF-1处理48小时后,收集细胞,用预冷4℃PBS洗三遍后,加入碘化丙碇（PI:50mg/ml,Triton-X100 1.0%）1ml,4℃避光反应30分钟,用流式细胞仪应用Muticycle AV分析软件测定细胞周期和细胞凋亡率。检测细胞凋亡,实验组共分5组,分别加入IGF-1、硼替佐米、地塞米松培养72小时后,检测方法同前。5.流式细胞术检测IGF-1对RPMI8226细胞细胞表面黏附分子CD44表达的影响取对数生长期的RPMI 8226细胞1×106个,加入IGF-1培养72小时后,收集细胞,PBS洗三遍,加入抗CD44抗体,室温避光反应30分钟,用流式细胞仪应用Muticycle AV分析,黏附分子CD44表达水平以阳性细胞百分数表示。6. IGF-1对RPMI8226细胞与骨髓基质细胞黏附的影响取对数生长期的骨髓基质细胞（1×105/ml）接种于96孔平底培养板中,24小时后骨髓基质细胞贴壁后,弃上清液,每孔加入5×104个RPMI8226细胞,分别加入不同终浓度的IGF-1处理24小时后,弃去培养上清液,用PBS洗去未黏附的细胞,每孔加入20μl MTT溶液（5mg /ml）,继续孵育4小时,吸去上清,每孔加入150μl二甲基亚砜（DMSO） ,振荡器充分振荡后于酶标仪570nm处测各孔吸光度值。计算细胞黏附率。7.IGF-1对RPMI8226细胞侵袭的影响细胞的侵袭是在24孔Transwell小室进行的,每孔上室加入无血清培养液培养12小时后的RPMI8226细胞悬液100μl,下室放含牛清培基和不同浓度IGF-1共500μl,培养24小时,取出带膜小室,PBS充分洗膜,PBS浸湿的棉棒轻轻擦净上室的细胞,滤膜自然风干,HE染色20分钟,PBS充分漂洗,小心取下膜封片,400倍显微镜下计数10个不同视野的穿膜细胞数,取平均数计算。结果:1.IGF-1促进多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226增殖,在一定浓度范围内呈时间剂量依赖关系。IGF-1浓度为12.5、25、50、100、200ng/ml时,24小时的细胞增殖率分别为（14±6）%、（41±9）%、（61±7）%、（77±14）%、（92±14）%; 48小时的细胞增殖率分别为（20±8）%、（42±9）%、（65±11）%、（77±9）%、（89±9）%; 72小时的细胞增殖率分别为（23±6）%、（44±7）%、（67±11）%、（80±12）%、（90±10）%。2.IGF-1促进多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226细胞周期从G1期进入S期,IGF-1浓度为50、100、200 ng/ml时,培养48小时后,S期细胞所占比例分别为44%、55.8%、55.1%。3.IGF-1可减少硼替佐米和地塞米松诱导的RPMI8226细胞凋亡,硼替佐米和地塞米松组,细胞的凋亡率分别为32.81%、46.67%,和IGF-1共同培养72小时后细胞的凋亡率分别为20.73%、1.95%。4.IGF-1可上调RPMI8226细胞表面黏附分子CD44的表达,50ng/ml IGF-1作用72小时后,CD44表达率由3.7%上升至4.6%。在RPMI8226与骨髓基质细胞共培养体系中,IGF-1浓度为25、50、200ng/ml时能够促进RPMI8226细胞与骨髓基质细胞的黏附,黏附率分别为23.8%、30%、38.2%。5.IGF-1对骨髓瘤细胞侵袭的影响,对照组穿膜细胞数为20个/400倍视野,经作用24小时后,,各浓度分别25ng/ml、50ng/ml,穿膜细胞数分别为68个/400倍视野、147个/400倍视野。结论:1.在一定浓度范围内,IGF-1促进人多发性骨髓瘤细胞RPMI8226增殖,且呈时间、浓度依赖性。2.RPMI8226细胞经IGF-1作用48小时后,G0/G1期细胞比例明显减少,而S期细胞比例明显增多,且可抑制硼替佐米、地塞米松诱导的细胞凋亡。3.IGF-1可上调人多发性骨髓瘤细胞RPMI8226表面黏附分子CD44的表达,随IGF-1浓度的增加细胞黏附和侵袭能力增强。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 胰岛素样生长因子-1 对多发性骨髓瘤细胞RPMI8226 作用的初步探讨
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 胰岛素样生长因子-1 研究新进展
• 致谢
• 个人简历