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杉木、杨树激光显微切割体系的建立及RNA质量的控制

2020-11-23阅读(852)

杉木、杨树激光显微切割体系的建立及RNA质量的控制

论文摘要

激光显微切割技术（Laser Microdissection, LMD）是在显微下通过显微操作系统对欲选取的材料（组织,细胞群,细胞,细胞内组分或染色体区带等）进行切割分离并收集用于后续研究的技术,具有快速、准确且操作简便的特点。它成功的解决了大块分离组织中的细胞功能异质性问题,是分子生物学和基因组学一项革命性的技术。近几年来,激光显微切割技术逐渐从动物和医学研究中拓展到植物研究中来,用于快速准确地将目标细胞或细胞群从植物组织中分离,进行后续的分子和生化分析。木材的径向生长是维管形成层向内分化为次生木质部和向外分化为次生韧皮部的结果。利用分子和细胞学的方法研究木材的形成的基因表达与调控是科学家们近年来努力要解释的重要科学问题。但由于传统的方法很难将影响木材形成的关键活性组织区域形成层从或提上加以完整和清晰分离,人们对形成层的认识还相当有限。如何提高取材部位的准确性,是研究形成层区细胞分化分子机理的关键所在。20世纪90年代由于激光显微切割技术的进展使得这方法的研究变得容易起来。本研究首先用杉木、杨树两种树种为实验材料,建立了茎段的冰冻切片技术。通过对杉木、杨树试管苗实施不同的固定方法和预处理方法,确定了以卡诺固定、蔗糖磷酸缓冲液保护加液氮冷冻的方法制片。冰冻切片的适宜条件为:卡诺固定4-6小时,10%蔗糖磷酸缓冲液保护6-12小时,OCT包埋之后用液氮冷冻50s-90s。切片后脱水处理对切片的质量有一定程度的改善。建立的冰冻切片方法成功应用到田间杉木和杨树材料中,最薄切片厚度可至10μm,切片清晰完整,细胞结构易于辨认。本实验系统地研究了木本植物茎段的切片方法,突破了木本植物冰冻切片易破碎的瓶颈,为激光显微切割技术在木本植物的细胞分子生物学研究中应用打下扎实的基础。用Leica AS LMD激光显微切割系统切割杉木、杨树田间材料的冰冻切片,厚度为12μm,10×物镜下,经过优化的激光参数为:Aperture 10～13, Intensity 45～46, Speed 3～5。分别收集了约6000个形成层细胞。用Qiagen RNeasy Micro Kit抽提RNA。由于从显微切割的组织中提取的为微量RNA,不能用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳均不能检出。本研究首先用RT-PCR检验RNA。用β-Actin引物扩增出了400bp左右的条带。说明RNA大部分没有降解。用杉木特异性引物Expansin 2全长引物扩增杉木形成层cDNA,扩增出约1400bp的条带,说明RNA完整性较好。从6000个杨树形成层细胞中提取的RNA,用Agilent 2100 Bioanalyzer分析,RNA浓度: 1395 pg/μl;rRNA Ratio [28S/18S]: 1.3;RNA Integrity Number [RIN]: 7.1。RNA完整性较高,基本没有降解。从毛细管电泳图中可以看出18S和28S的荧光峰狭长且很高,说明了RNA纯度比较高,没有DNA的污染。经过激光显微切割的杨树形成层细胞的RNA的产出率为2.325pg total RNA/cell。该RNA的质量较好,达到用于表达谱芯片的RNA标准。但需要经过RNA线性放大,才可以用于芯片研究。本研究填补了目前木本植物的激光显微切割分离技术的空白,突破了林木发育和分子遗传学研究中组织定位的精确取材实验技术体系。为发现与木材生长和材性性状相关的重要基因提供实验技术关键基础。本研究建立的技术系统还可以推广到其他植物组织和器官的发育和遗传学研究。

论文目录

  • 致谢
  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 文献综述
  • 引言
  • 1. 激光显微切割技术简介
  • 1.1 激光显微切割技术的发展和原理
  • 1.1.1 激光显微切割技术的发展历史
  • 1.1.2 激光捕获显微切割系统
  • 1.1.3 PALM Microbeam 激光显微切割系统
  • 1.1.4 Leica AS LMD 激光显微切割系统
  • 1.2 激光显微切割技术的特点
  • 2 激光显微切割技术下使用的组织切片技术
  • 2.1 总述
  • 2.1.1 样品固定的目的
  • 2.1.2 固定液的选择
  • 2.2 冰冻切片法
  • 2.3 石蜡切片法
  • 2.4 其他制片方法
  • 2.5 加强目标细胞识别的准确性
  • 3. 与激光显微切割相结合的技术发展与应用
  • 3.1 激光显微切割技术的应用概述
  • 3.2 RNA 线性扩增
  • 3.3 SMART 技术
  • 4 激光显微切割技术在植物研究中的应用进展
  • 4.1 RNA 水平基因表达分析
  • 4.2 研究植物与病原体的相互作用
  • 4.3 用激光显微切割技术进行DNA 分析
  • 4.4 用激光显微切割技术进行蛋白质分析
  • 5. 展望
  • 6. 本实验的研究目的和意义
  • 第二章 杉木和杨树组织冰冻切片技术
  • 1. 材料、仪器与试剂
  • 2. 实验方法
  • 2.1 冰冻切片的一般步骤与方法
  • 2.2 适合杨树、杉木组培苗的冰冻切片方法研究
  • 2.3 脱水方法
  • 2.4 杉木、杨树田间植株的冰冻切片方法
  • 3. 结果与分析
  • 3.1 植物冰冻切片条件的优化
  • 3.2 杨树、杉木组培苗的冰冻切片方法
  • 3.3 脱水的效果
  • 3.4 杉木、杨树田间植株的冰冻切片
  • 4. 讨论
  • 5. 冰冻切片机日常使用和保养
  • 第三章 激光显微切割收集目标细胞
  • 1. 材料、仪器及试剂
  • 2. 实验步骤
  • 2.1 开启Leica AS LMD 系统
  • 2.2 校准
  • 2.3 正式切割
  • 2.4 图像和数据收集
  • 2.5 取出收集管
  • 2.6 关闭系统
  • 3. 结果与分析
  • 4. 讨论
  • 5. 激光显微切割仪器的保养和使用
  • 第四章 提取RNA 及检测
  • 1. 材料和试剂
  • 1.1 植物细胞
  • 1.2 生化试剂
  • 2. 实验方法
  • 2.1 实验前的试剂准备
  • 2.2 实验步骤
  • 3. 结果与分析
  • 3.1 RT-PCR 结果分析
  • 3.2 Agilent 2100 bioanalyzer 分析RNA
  • 4. 讨论
  • 4.1 影响RNA 产量和质量的因素
  • 4.2 检测 RNA 的方法
  • 5. 防止RNA 降解的措施
  • 第五章 总结与展望
  • 1. 总结
  • 1.1 冰冻切片技术要点
  • 1.2 激光显微切割技术要点
  • 1.3 提取RNA 的技术要点
  • 2. 下一步研究展望
  • 2.1 植物发育遗传学领域
  • 2.2 建立杉木形成层文库
  • 2.3 杨树表达谱基因芯片杂交
  • 参考文献

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