脑膜炎奈瑟氏菌表面蛋白NspA基因的克隆与原核表达

论文摘要

脑膜炎奈瑟氏菌是流行性脑膜炎的病原菌,根据其荚膜多糖抗原不同可分为13个血清群,包括A, B, C, D, X, Y, Z,29E, W125, H, I, K,根据细菌外膜蛋白和多脂糖成分不同可再分为血清型与亚型。我国流行菌群以A群为主,其次为B群和C群。近年来B群致病率有上升的趋势。1997年Matin等报道,脑膜炎球菌的外膜上存在一种低分子量的保守的表面蛋白命名为脑膜炎奈瑟菌表面蛋白NspA （Neisseria surface Protein）, NspA能在菌体持续表达,抗NspA单克隆抗体能保护小鼠免于致死量脑膜炎奈瑟氏菌的攻击,用重组的NspA免疫小鼠能诱导免疫保护,是最具有潜力的脑膜炎奈瑟氏菌疫苗的候选抗原,渴望用于制备成防治流脑的疫苗。本文以NspA基因为目的基因,参照Genbank中已有的序列和原核表达质粒PMD18-T, pSIP-409的序列,按照其开放读码框架,设计引物,体外扩增目的基因,并将目的基因插入到PMD18-T, pSIP-409,得到重组质粒PMD18-T-NspA, pSIP-409-NspA.并对PMD18-T-NspA基因的序列进行测定,进一步将目的基因与pSIP-409-NspA载体连接转入大肠杆菌表达目的基因,实现NspA重组蛋白在大肠杆菌中的高效表达。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 第一章 绪论
• 1.1 脑膜炎的流行病学特性
• 1.2 脑膜炎的发病原因及预防措施
• 1.2.1 发病机制
• 1.2.2 免疫性
• 1.2.3 预防措施
• 1.3 脑膜炎奈瑟氏菌是流行性脑膜炎的病原菌
• 1.4 脑膜炎奈瑟氏菌的国内外研究现状
• 1.5 研究的主要内容
• 1.6 研究的目的意义
• 1.7 技术路线
• 第二章 脑膜炎奈瑟氏菌的分离及鉴定
• 2.1 实验材料及仪器设备
• 2.2 培养基的配制
• 2.3 实验方法
• 2.4 脑膜炎奈瑟氏菌分离鉴定的结果
• 第三章 脑膜炎奈瑟氏菌NspA基因的克隆与序列分析
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 药品、载体及材料
• 3.1.2 仪器与设备
• 3.1.3 培养基的配制
• 3.1.4 大肠杆菌DH5 α感受态细胞的制备
• 3.1.5 实验所用溶液
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 脑膜炎奈瑟氏菌冷冻真空干燥保存
• 3.2.2 菌种的复苏
• 3.2.3 脑膜炎奈瑟氏菌基因组的提取
• 3.2.4 PCR扩增NspA基因
• 3.2.5 PCR产物琼脂糖凝胶电泳
• 3.2.6 PCR产物的回收
• 3.2.7 PMD-18T-NspA质粒载体重组构建
• 3.2.8 PMD-18T-NspA重组质粒的转化
• 3.2.9 重组质粒DNA的小量制备
• 3.2.10 pMD-18T-NspA重组质粒的鉴定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 基因组DNA的提取结果
• 3.3.2 脑膜炎萘瑟氏菌NspA基因的PCR扩增结果
• 3.3.3 PCR产物的回收结果
• 3.3.4 pMD18T-NspA重组质粒电泳图谱
• 3.3.5 重组阳性克隆质粒PMD-18T-NspA的筛选与鉴定
• 3.3.6 目的基因片段序列测序结果和同源性分析
• 3.4 实验讨论
• 第四章 NspA基因重组乳酸菌表达载体的构建及原核表达
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 实验药品
• 4.1.2 仪器设备
• 4.1.3 实验所用溶液
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 PMD18T-NspA及pSIP-409空质粒的双酶切
• 4.2.2 pSIP-409-NspA重组质粒的构建
• 4.2.3 pSIP-409-NspA重组质粒载体的转化
• 4.2.4 pSIP-409-NspA重组质粒载体在大肠杆菌中的诱导表达
• 4.2.5 重组质粒表达产物的SDS-PAGE电泳
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 NspA基因和pSIP-409载体回收
• 4.3.2 重组质粒pSIP-409-NspA的小量提取
• 4.3.3 重组质粒pSIP-409-NspA的PCR和酶切鉴定
• 4.3.4 SDS-PAGE检测结果
• 4.4 讨论
• 结论
• 致谢
• 参考文献