pMADS3基因两种干涉载体对矮牵牛遗传转化的初步研究

论文摘要

矮牵牛作为一种双子叶植物,既是重要的观赏植物,又是植物分子生物学研究的模式植物之一。作为模式植物,矮牵牛除了具有植物分子生物学研究的优点之外,也由于其花器官较大、转化体系完善、便于观察等特点,近年来成为研究MADS-BOX基因家族的最主要的物种之一。本研究以得到重瓣矮牵牛和发掘新基因丰富花发育理论为目的,用根癌农杆菌介导的叶盘转化法将一个与花型相关的MADS-BOX类基因PMADS3及其保守片段PMa以RNAi的形式转化矮牵牛V26以及Blind-like,得到相应的Kan抗性株系,随机抽取相应的株系进行PCR鉴定,均出现了阳性条带,初步断定目的基因已转入。主要研究情况如下:1.优化了矮牵牛的高频再生遗传转化体系:优化了矮牵牛自交系品种V26及Blind-like的再生遗传转化体系。2.以RNAi干涉的形式分别转化基因PMADS3及其保守片段PMa,并获得相应抗性株系若干:通过根癌农杆菌介导的叶盘转化法分别将两个干涉载体转入两种矮牵牛材料中,获得四个Kan抗性转化组合PMADS3&V26;PMADS3&Blind-like;PMa&V26;PMa&Blind-like 150、150、80、80个。随机抽取PMADS3&V26;PMADS3&Blind-like;PMa&V26组合株系4;11;16个,经PCR检测分别有4;9;15个株系呈阳性,初步断定矮牵牛V26、Blind-like转化率分别为93.75%、81.82%。3.转基因矮牵牛的表型观察:将四个组合所得到的转基因植株移栽于田间,对PMADS3&V26组合的33个株系进行观察,有9株出现了不同程度表型变异。其中,6株出现的变异主要表现为花朵大于对照、花丝上着生花瓣、花瓣增多,丝药连接处瓣化,自交授粉不结实。3株出现的变异主要表现为花药形状改变:末端变尖;部分花药转变成花瓣且不能正常开裂。而对PMADS3&Blind-like组合的22个株系进行观察,有9株出现了不同程度表型变异;对比未转化的其主要表现为:出现花瓣;花瓣呈不同角度的开张;花瓣顶端略有花药痕迹;花瓣内部附着形状变化的退化的花药;花冠筒伸长;花药体积膨大;花丝明显变长、花丝上着生花瓣。PMa&V26;PMa&Blind-like没有出现变异。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 1 文献综述
• 1.1 MADS-BOX基因及花器官发育研究
• 1.1.1 MADS-BOX基因的起源、结构及功能
• 1.1.2 花型基因工程研究
• 1.1.3 AG家族基因
• 1.2 矮牵牛相关研究进展
• 1.2.1 矮牵牛相关花形态发育突变体的研究
• 1.2.2 矮牵牛的遗传转化
• 1.3 本研究的背景、意义与内容
• 1.3.1 研究背景
• 1.3.2 本研究的意义、内容
• 2 材料和方法
• 2.1 矮牵牛无菌苗体系的建立
• 2.1.1 材料和培养基
• 2.1.2 培养方法
• 2.2 转化载体材料及培养方法
• 2.2.1 根癌农杆菌菌株及质粒
• 2.2.2 根癌农杆菌培养
• 2.3 试剂及配方
• 2.3.1 组培用试剂
• 2.3.2 生化试剂
• 2.4 矮牵牛叶片再生体系的调整
• 2.4.1 矮牵牛叶片最佳再生培养基的确定
• 2.4.2 不同部位叶片的再生比较实验
• 2.5 农杆菌介导的叶盘法转化矮牵牛
• 2.5.1 材料和培养基
• 2.5.2 转化方法
• 2.5.3 卡那霉素最佳选择压力的确定
• 2.5.4 不同抑菌方法的比较
• 2.5.5 不同侵染方式对农杆菌侵染的影响实验
• 2.5.6 乙酰丁香酮对转化的影响实验
• 2.5.7 不同生理状态叶片的农杆菌侵染实验
• 2.5.8 预培养对转化的影响实验
• 2.5.9 移栽实验
• 2.6 转基因植株的分子检测
• 2.6.1 抗性苗的总DNA提取
• 2.6.2 PCR检测
• 2.7 转基因植株的田间表型性状观察
• 2.7.1 观察植株花型的变化
• 2.7.2 转基因植株对花粉数量、形态的影响实验
• 2.7.3 转基因植株对结实的影响实验
• 3 结果与分析
• 3.1 不同激素的配比实验结果
• 3.2 不同部位叶片的再生情况比较
• 3.3 卡那霉素对叶片再生选择压力的实验
• 3.4 外植体对抑菌剂敏感度的实验
• 3.5 卡那霉素生根选择压力的实验
• 3.6 不同抑菌方式及不同侵染方式对农杆菌侵染的影响实验
• 3.7 乙酰丁香酮对转化的影响实验
• 3.8 不同环境条件叶片的农杆菌侵染实验
• 3.9 预培养对转化的影响实验
• 3.11 移栽实验
• 3.12 根癌农杆菌介导的叶盘法转化的结果
• 3.13 抗性植株的PCR检测
• 3.14 转基因植株的田间表型性状观察
• 3.14.1 转基因植株对花型的影响
• 3.14.2 转基因植株对花药形状、开裂的影响
• 3.14.3 转基因植株对花粉数量、形态的影响
• 3.14.4 转基因植株对结实的影响
• 4 问题和讨论
• 4.1 矮牵牛组织培养中存在的问题
• 4.2 叶盘转化中存在的问题
• 4.3 影响农杆菌转化的因素
• 4.4 关于转化植株的检测
• 4.5 关于花型
• 4.6 对转化体的进一步思考以及实验展望
• 参考文献
• 致谢