冻干血小板对大鼠难愈合创伤修复作用的研究

论文摘要

难愈性创伤是指损伤且并发有抑制创面愈合的疾病,使创面愈合困难并造成严重后果。比较典型的如糖尿病性溃疡、放射性溃疡以及褥疮等。难愈性创伤给病人带来极大的痛苦,是临床治疗的一大难题。2004年,Mazzucco提出局部应用高浓度血小板,可以为难愈合创口提供大量生长因子,促进伤口愈合,并首次使用自体富血小板胶治疗难愈性糖尿病足部溃疡,取得较好的效果。随后,局部应用自体血小板浓缩物治疗难愈性创伤成为研究的热点。然而,自体新鲜血小板浓缩物在应用过程中存在一定的缺陷,如提取病人自体血小板操作比较繁琐、制备的血小板难于储存、难于量化、血小板释放生长因子的能力也会受到临床病情的影响,使一些临床随机试验产生了无效的结果,限制了该项治疗方法的广泛应用。相比之下,冻干血小板体积小、重量轻,易于保存,生长因子含量稳定,易于量化。本研究尝试应用冰冻干燥血小板治疗难愈性创伤,从而提高血小板浓缩物的可利用性和可操作性。糖尿病动物模型的建立:在难愈性创伤的实验研究中,国外常采用遗传性糖尿病的大、小鼠（db/db鼠）建立难愈性创伤模型。这种转基因糖尿病动物模型最接近人类糖尿病,应用价值较高;但动物价格昂贵,饲养、繁殖条件要求严格,国内较少应用。国内广泛采用药物诱导糖尿病法,建立难愈性创伤模型,制作方法相对简单,应用更为广泛。本研究采用STZ 65mg/kg.b.w.对大鼠腹腔注射制备糖尿病模型。注射STZ后72小时血糖明显升高,血糖值均大于16.7mmol/L,尿糖4+,多饮多食多尿体征明显,可以持续至少9周。8周时有部分大鼠产生白内障症状。糖尿病大鼠建模一周后,体重明显低于正常对照组,发病5周后,体重基本不再增长;糖尿病大鼠表皮变薄,皮肤毛细血管减少,胶原变性;肾重/体重比明显增大,通过HE染色可以观察到糖尿病大鼠肾组织细胞外基质合成增多,基底膜增厚和系膜基质增多。综上所述,该模型已经产生与人糖尿病晚期相似的症状,具有发生难愈性溃疡的基础。难愈性全皮层缺损创伤动物模型的建立:将实验动物分为5组,分别为正常大鼠以及血糖升高后3周、5周、7周和9周的糖尿病大鼠组。对以上5组大鼠进行全皮层缺损手术,建立直径2cm的圆形全皮层缺损创口,比较其愈合速度和愈合时间。正常组和3周组在愈合过程中,各时间点再上皮化率无显著差异（p>0.05）,其愈合时间分别为15.7±1.4天和17.0±2.6天,无显著性差异（p>0.05）;而5周组和7周组愈合速度明显落后于正常对照组,愈合时间分别为24.8±4.2天和25.2±3.7天,与正常组比较延迟约10天,而且具有难愈性创伤的特点;5周和7周组愈合速度和愈合时间比较差异不显著（p>0.05）;9周组动物由于糖尿病发病时间较长,在实验过程中动物死亡较多;如果糖尿病发病时间短、病变较轻,难以建立难愈性创伤模型;如果时间太长,大鼠病变加重,死亡率增加。因此,我们选择在糖尿病动物模型发病5-7周后,建立全皮层缺损模型,并利用该模型来研究冻干血小板在难愈合创伤修复过程中的作用。冻干血小板EGF和VEGF含量的分析:血小板可以释放对创伤修复具有促进作用的主要6种生长因子（TGF、PDGF、EGF、VEGF、IGF和FGF）。在前期实验比较了新鲜血小板和冻干血小板所释放PDGF、TGF含量的基础上,我们进一步比较了对创伤修复具有促进作用的EGF和VEGF的含量。结果表明,冻干血小板PPP复溶、凝血酶活化后EGF和VEGF的释放量分别为312.9±67.3 pg/mL和512.2±43.8 pg/mL,与新鲜血小板（298.8±65.9 pg/mL和506.6±38.9 pg/mL）比较,无显著性差异（p>0.05）;生理盐水复溶冻干血小板,EGF和VEGF的释放量分别为295.7±45.2 pg/mL和489.3±62.3 pg/mL,与PPP复溶活化后释放生长因子能力没有显著性差异（p>0.05）,说明冻干血小板具有与新鲜血小板相同的生长因子释放能力;同时研究了冻干血小板分别用PPP和盐水复溶后,具有相同的生长因子释放能力,为制备不同的冻干血小板应用剂型提供理论依据。冻干血小板对糖尿病大鼠皮肤创伤模型修复作用的研究:在实验中,我们将糖尿病大鼠皮肤创伤模型分为4组,未治疗组（NT）、rhEGF治疗组（GFT）、冻干血小板水剂治疗组（LYPT1）、冻干血小板胶治疗组（LYPT2）。LYPT1为将冻干血小板生理盐水复溶后,加入凝血酶活化后直接喷涂在创面。LYPT2为将冻干血小板用PPP复溶后,加入凝血酶和钙离子制备PRG,涂在创面。结果表明,NT组、GFT组、LYPT1组和LYPT2组的创口愈合时间分别为25.4±3.8天、20.6±2.7天、16.2±1.3天和17.8±2.3天;GFT、LYPT1和LYPT2组创口愈合时间与NT组比较显著缩短（p<0.05）;表明生长因子对大鼠难愈合创伤具有治疗作用。LYPT1和LYPT2组愈合时间快于rhEGF组愈合时间（p<0.05）,提示血小板释放的多种天然生长因子的治疗效果优于单一等量的rhEGF。LYPT1和LYPT2组愈合时间相比较差异不显著（p>0.05）,说明用盐水复溶的冻干血小板与新鲜血小板胶具有相同的治疗效果。综上所述,本研究建立了糖尿病大鼠难愈性创伤的实验动物模型,建模药物STZ,用量65mg/kg.b.w,给药途径为SD大鼠腹腔注射;保持高血糖、尿糖9周以上;在SD大鼠血糖持续稳定升高5周后,行全皮层缺损手术。利用该模型评价冻干血小板治疗难愈性创伤的效果,结果表明,冻干血小板具有促进难愈性皮肤创伤的修复作用;盐水复溶与PPP复溶的冻干血小板具有相同的治疗效果,进一步证实了促进难愈性创伤愈合的关键因素是血小板中含有的大量生长因子。本研究为治疗糖尿病性皮肤难愈合创伤提供理论基础。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 难愈合创伤动物模型的建立
• 第一节 实验性糖尿病动物模型的建立
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第二节 难愈性全皮层缺损创伤动物模型的建立
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 冻干血小板对难愈性全皮层缺损创伤修复作用的研究
• 第一节 冻干血小板的EGF 和VEGF 含量的分析
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二节 冻干血小板对糖尿病大鼠皮肤创伤模型修复作用的研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 总结
• 参考文献
• 发表文章
• 个人简历
• 致谢