论文摘要
第一部分血型A抗原模拟多肽的筛选目的:筛选血型A抗原的模拟多肽。方法:用血型A抗体NaM87-1F6对噬菌体随机12肽库进行三轮筛选,随机挑选32个噬菌体克隆,经噬菌体酶联免疫吸附试验（ELISA）、噬菌体微筛选鉴定噬菌体与抗体的结合力。测定特异性噬菌体DNA序列并推导其展示的多肽序列。凝集抑制试验检测噬菌体展示多肽对血型A抗原的模拟作用。结果:1.经三轮筛选和相应的鉴定后得到7个抗A抗体NaM87-1F6的特异性噬菌体克隆。2.其中6噬菌体（C5,22,23,26,27,31）展示的多肽序列为EYWYCGMNRTGC（将此多肽序列命名为P5,展示此多肽的噬菌体以C5为代表）,另一噬菌体克隆C17展示的多肽序列为QIWYERTLPFTF（将此多肽序列命名为P17）。3.凝集抑制试验提示展示这两个多肽的噬菌体可以抑制A型红细胞的凝集作用,阴性对照噬菌体原肽库不能抑制这种凝集作用。结论:实验结果提示,多肽EYWYCGMNRTGC,QIWYERTLPFTF可以模拟血型A抗原的表位。此两种多肽具有建立新型诊断和亲和滤除抗A抗体方法的潜能。第二部分血型A抗原模拟多肽的GST融合表达目的:构建表达血型A抗原模拟多肽的融合表达载体,鉴定融合表达蛋白模拟血型A抗原的能力。方法:PCR扩增血型A抗原模拟多肽（P5、P17）和谷胱苷肽S-转移酶（GST）编码基因,并连接成P5-GST和P17-GST,双酶切后重组入原核表达质粒pET28b,构建质粒pET28b-P5-GST和pET28b-P17-GST。通过酶切、测序鉴定重组子。以BL21（DE3）为表达菌,在IPTG诱导下表达P5-GST和P17-GST融合蛋白,Ni-NTA柱纯化蛋白。竞争ELISA鉴定融合蛋白对噬菌体展示多肽抗原活性的模拟作用,红细胞凝集抑制实验分析融合蛋白模拟血型A抗原的能力。结果:1.成功构建P5、P17基因和GST基因融合后的原核表达质粒pET28b-P5-GST和pET28b-P17-GST。2.P5-GST和P17-GST基因在宿主菌中高效表达并得到纯化。3.P5-GST和P17-GST蛋白以浓度依赖的方式抑制A型红细胞的凝集作用。结论:原核表达的多肽融合蛋白P5-GST和P17-GST可模拟天然血型A抗原,具有替代天然A抗原用于发展新型抗A抗体检测方法和滤除材料的潜能。第三部分模拟多肽融合蛋白检测血型抗体初步研究目的:探讨多肽融合蛋白EYWYCGMNRTGC-GST和QIWYERTLPFTF-GST在血型A抗体检测中的应用价值。方法:收集多份健康献血者血浆,试管凝集实验对血型抗体进行ABO定型,滴度测定;用基于GST融合表达多肽EYWYCGMNRTGC（P5-GST）,QIWYERTLPFTF（P17-GST）的ELISA方法检测血型抗体;统计学分析比较ELISA方法与经典凝集试验检测血型抗体的效能。结果:1.收集到120份健康献血者血浆,其中90份为抗A抗体阳性,30份抗A抗体阴性。2.基于P5-GST的ELISA检测血浆抗A抗体实验受试者工作特性曲线的曲线下面积分别为0.873（P<0.001）,ELISA结果A值与凝集试验抗体滴度间的Spearman相关系数分别为0.728（P<0.001）。基于P5-GST的ELISA在阈值为0.280时其敏感度、特异度分别为80%和76.7%。基于P17-GST的ELISA未能显示出具有检测血型抗体A的效能。结论:基因工程多肽EYWYCGMNRTGC-GST融合蛋白具有一定的血型A抗体检测能力,为开发新型的血型抗体检测方法提供了思路。