论文摘要
目的:研究粘附素5 N 端CED-4（cadherin extracellular domain-4）基因经重组逆转录病毒介导转染人乳腺癌细胞MDA-MB-435 及其诱导MDA-MB-435 细胞凋亡的分子调控机制。方法:前期工作已完成CED-4 基因克隆和鉴定,并与克隆载体连接转化大肠杆菌,获取复制质粒。本实验承接前期工作,主要实验方法:⑴酶切鉴定质粒:限制性内切酶BspHⅠ、BglⅡ、AflⅡ分别酶切质粒pVSV-G、pGAG-POL、pMSCV、pMSCV-CED4,电泳鉴定质粒。⑵293包装细胞包装产生重组逆转录病毒:脂质体介导质粒pVSV-G、pGAG-POL、pMSCV 、pMSCV-CED4,转入293 包装细胞,经G418 筛选,293 细胞包装产生含目的基因和不含目的基因的重组逆转录病毒。⑶病毒感染靶细胞MDA-MB-435 细胞:两组重组逆转录病毒（实验组和实验对照组）分别感染MDA-MB-435 细胞,增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）作为基因转染阳性细胞标记,第三天观察绿色荧光,2 周后密切观察细胞形态变化。⑷细胞凋亡的检测:光学显微镜下显微观察凋亡细胞形态,Annexin V-BIOTIN apoptosis detection kit 细胞染色,流式细胞仪检测细胞凋亡; ⑸RT-PCR:提取实验组、实验对照组和空白对照组三组细胞总体RNA,设计引物,经反转录PCR 扩增目的基因CED-4 mRNA、Integrinβ1 亚基mRNA、原癌基因c-fos mRNA,琼脂糖凝胶电泳;⑹Westhen blot 检测c-fos 蛋白的表达。结果:⑴质粒DNA 大小正常:酶切质粒,电泳结果表明,质粒pVSV-G、pGAG-POL、pMSCV、pMSCV-CED4 大小正常,未发生降解。⑵293 细胞包装产生重组逆转录病毒:质粒转化293 细胞,48小时后,荧光显微镜下可见绿色荧光。⑶重组逆转录病毒感染MDA-MB-435细胞:逆转录病毒感染MDA-MB-435 细胞,48 小时后荧光显微镜下可见绿色荧光,提示病毒介导基因转染成功。⑷RT-PCR 检测到目的基因CED-4 基
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