论文摘要
玉米的CMS可划分为T、C、S三种类型,其中S型CMS为配子体雄性不育类型,其胞质不育基因被认为与线粒体中的orf355和orf77相关（Zabala,1997）。人们研究发现orf355和orf77在不育花粉中被共转录为两个转录本,而这两个转录本的丰度在育性恢复的花粉中却大大降低（肖海林,2006）,在orf77翻译过程中由于orf77经过RNA编辑提前产生终止密码子,使得orf77的蛋白质产物理论上成为一个只有17个氨基酸的多肽（Gallagher et al.,2002）,这个多肽与ATP9的C端穿膜结构域有很高的同源性,人们推测它可能会结合到线粒体内膜上导致膜渗透性的失常而启动PCD过程,或者干扰ATP9的正常功能而使线粒体的呼吸链出现异常,由于能量供应不足而启动PCD过程,从而引起花粉败育。本课题以S-CMS雄性不育相关基因orf355和orf77为研究对象,通过结构预测、原核表达、洋葱表皮定位、蛋白质双向电泳等来进行研究,获得的主要结果如下:1.利用软件TMHMM Serverv.2.0对orf77和orf355的蛋白质二级结构进行预测,可知orf77和orf355的蛋白质产物具有穿膜结构域,具有很强的疏水性。2.利用DpnI介导的定点诱变使orf77突变成orf17,接着分别把orf17、orf60、orf77转入到大肠杆菌表达载体pET-15b中,诱导蛋白质表达测定菌液浓度做生长曲线,发现pET-15b-orf77中诱导蛋白质表达后生长曲线有下降的过程,pET-15b-orf17和pET-15b-orf60中无变化,说明了完整的orf77产物具有毒性。3.把orf77和orf355分别转入到原核表达载体pET-28a、pET-32a、pEGX-KG、pTYB-12中均得不到其目的蛋白质产物。体外直接合成orf17短肽未成功,利用体外转录翻译偶联系统也未得到orf77的蛋白质产物。4.把EGFP转入到表达载体pET-28a中,诱导表达可得到EGFP的蛋白质产物,在荧光显微镜下观察有强烈荧光产生;在pET-28a-EGFP中分别转入orf77和orf355诱导表达后荧光十分微弱,这就显示了转入orf77和orf355后能够明显阻碍EGFP的翻译。5.抽提pET-28a-EGFP-orf77和pET-28a-EGFP-orf355大肠杆菌RNA,做RT-PCR。结果显示,各时期均存在orf77、orf355的转录本,且诱导后转录本的量有了明显提高,可知orf77和orf355在融合表达过程中转录正常。6.抽提pET-28a-EGFP和pET-28a-EGFP-orf77大肠杆菌总蛋白进行双向电泳,观察分析发现前者比后者总蛋白点数多,选取pET-28a-EGFP与pET-28a-EGFP-orf77存在显著性差异的9个点进行质谱检测,结果显示这9个点中有8个代谢活动相关,1个与细胞骨架系统形成相关。7.对orf77和orf355进行洋葱表皮定位,不仅显示了orf77和orf355最终定位在细胞膜,更证明了orf77和orf355在真核细胞中能正常翻译成蛋白质。