应用四环素表达系统上调内源性TGF-β1表达对HL-60细胞增殖、分化及凋亡的影响

论文摘要

TGF-β1是迄今为止了解的功能最复杂的细胞因子之一,目前已知的功能主要有调节细胞生长和分化,诱导细胞凋亡,影响细胞粘连和细胞迁移,调节胚胎发育过程,促进细胞外基质的形成,促进创伤愈合,参与对免疫抑制及对炎症反应的调节等。近年来的研究表明TGF-β及其受体与肿瘤的发生、发展密切相关,TGF-β对肿瘤的作用是多样的,在肿瘤发生的早期可作为抑癌基因抑制细胞的增殖和分化,但在肿瘤的进展期则可抑制免疫功能、增加血管的生成、诱导细胞外基质的产生而促进肿瘤的侵袭和转移。在造血调控方面,TGF-β1主要发挥负性调控作用,是目前已知作用最强的血细胞增殖抑制因子,但对白血病的作用机制还有许多未解之迷。由于TGF-β1对不同的靶细胞表现出不同的生物学活性,因此通过体外定时、定量的控制其在靶细胞中的表达,对进一步深入研究其作用及机制具有重要意义。四环素诱导基因表达系统可以使基因表达在体外进行控制,在这一系统中,四环素（Tet）及其类似物强力霉素被作为有效的基因“控制开关”,这一系统的成功建立可以通过加入或移去四环素或类似物,对外源基因在有机体中表达进行准确、定量和特异地控制,为其应用于基因治疗提供新的手段。本研究通过将含人全长TGF-β1（hTGF-β1）cDNA插入四环素调控系统,构建了带有hTGF-β1基因的四环素调控真核表达载体,用脂质体转染法将上述载体及pcDNA6/TR双稳定转染HL-60细胞,用外源诱导物Tet准确定量调控TGF-β1在HL-60细胞的表达,研究这种细胞的生物学特性改变,同时观察转染外源性TGF-β1基因的HL-60细胞的体内致瘤性的改变,进一步探讨TGF-β1对白血病的作用及机制。本研究内容分以下部分:1.运用四环素调控系统,构建可调控的含人TGF-β1全长cDNA的真核表达载体。2.将构建好的真核表达载体及pcDNA6/TR质粒双转染入HL-60细胞,筛选出稳定表达TGF-β1的转染细胞株。3.通过Tet定量调控外源性TGF-β1在HL-60细胞的表达,研究不同TGF-β1表达水平对HL-60细胞增殖、分化、凋亡的影响。及其对bcl-2、c-myc、fas、bax、hTERT等凋亡相关基因与蛋白表达的影响。4.通过Tet定量诱导外源性TGF-β1基因在HL-60细胞表达研究其在裸鼠体内增殖的影响。取得了以下主要结果及结论:1.本研究成功地构建含hTGF-β1的pcDNA4/TO真核表达载体,通过PCR鉴定、酶切鉴定并最终经测序确认,命名为pcDNA4-TGF-β1。2.成功地筛选出双稳定转染pcDNA4-TGF-β1及pcDNA6/TR的HL-60单克隆细胞株,命名为TGFβ1-HL60细胞。3.以TGFβ1-HL60细胞为研究对象,通过添加不同剂量诱导剂Tet上调转染细胞TGF-β1表达量,进一步证实了TGF-β1上调可抑制HL-60细胞增殖、促进HL-60细胞分化和诱导细胞凋亡;采用半定量RT-PCR及Western-Blot方法研究发现,TGF-β1能通过上调bax基因及蛋白表达,下调bcl-2、c-myc、fas、hTERT等凋亡相关基因及蛋白表达,从而诱导细胞凋亡。4体内实验发现通过腹腔注射诱导剂Tet可以影响TGFβ1-HL60细胞裸鼠异种移植瘤的生长,高剂量组（Tet 10mg/kg ip）.和低剂量组（Tet 0.4mg/kg ip）对裸鼠异种移植瘤的抑制率分别为50.0%（p＜0.01）和20.7%（p＜0.05）。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 1cDNA真核表达载体pcDNA4-TGF-β₁的构建及其双稳定转染HL-60细胞的筛选'>第一部分 含人全长TGF-β₁cDNA真核表达载体pcDNA4-TGF-β₁的构建及其双稳定转染HL-60细胞的筛选
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 1基因修饰的HL-60细胞生物学特性研究'>第二部分 TGF-β₁基因修饰的HL-60细胞生物学特性研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 1定量表达对HL-60细胞裸鼠异种移植瘤作用的研究'>第三部分 TGF-β₁定量表达对HL-60细胞裸鼠异种移植瘤作用的研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢