水稻花药中Ca2+的定位与花粉细胞骨架荧光标记方法的探索

论文摘要

光敏雄性核不育水稻是培育杂交稻的重要种质资源,其雄性不育的细胞学机制与很多方面有关,包括绒毡层发育、ATP酶、Ca2+浓度、细胞骨架和细胞程序性死亡等。Ca2+作为植物的第二信使广泛参与并调节着植物体内的生理生化反应,其在花药发育过程中对花粉形成和发育起重要作用;细胞骨架紊乱导致细胞死亡的现象比较普遍。因此,研究不育水稻花药发育过程中Ca2+分布以及细胞骨架的变化与花粉败育的关系,有助于揭示光敏核不育水稻雄性不育的机理。本文采用焦锑酸钾沉淀法,观察了光敏核不育水稻（PGMR）农垦58S和正常可育品种农垦58N花药发育过程中药隔、药壁和花粉细胞中Ca2+的分布差异,分析不育花药中Ca2+分布与花粉败育的关系;以水稻为研究材料,采用几种不同的方法获得花粉细胞,分别进行微丝和微管的荧光标记和观察。主要研究结果如下:1.花药发育过程中Ca2+异常分布及其与雄性不育的关系（1）可育花粉单核晚期细胞表面聚集丰富的Ca2+沉淀,花粉壁发育完全,细胞质中Ca2+颗粒很少;而不育花粉细胞表面Ca2+较少,花粉外壁发育异常,不形成花粉内壁,细胞质中积累丰富的Ca2+沉淀。（2）可育花药绒毡层细胞在单核早期开始解体,单核晚期迅速解体;而不育花药在花粉母细胞时期启动解体,解体过程十分缓慢,一直持续至花粉败育。不育花药较可育花药提前形成乌氏体,但其表面无Ca2+沉淀分布,直到单核晚期才有明显分布,数量少于同期可育花药。除乌氏体以外,不育花药各壁层细胞中的Ca2+沉淀多于可育花药。（3）花药发育过程中,不育花药和可育花药药隔组织中的Ca2+沉淀都呈逐渐增多的趋势,同期相比,不育花药多于可育花药。结果表明,光敏核不育水稻绒毡层细胞提早解体及乌氏体功能异常,导致Ca2+向药室的运输发生障碍,致使花粉表面缺乏Ca2+而引起花粉外壁形成不正常;花粉发育后期细胞质内积累大量Ca2+是花粉败育的主要因素之一。2.花粉细胞骨架荧光标记方法（1）多聚赖氨酸粘片法:固定花药后压片,挤出花粉于涂有多聚赖氨酸的盖玻片上,对黏附在盖玻片上的花粉进行酶解和标记。结果表明,实验过程中花粉较易脱落,且一些组织碎片影响荧光观察,不易进行后期花粉标记,也不易进行微管荧光标记。（2）研磨—离心法:固定小花后,研磨压出花粉,过滤,离心收集花粉,在离心管中对花粉进行酶解和标记。结果表明该法与粘片法相比,花粉细胞损失很少,制片上的花粉细胞分布均匀,无背景杂质影响荧光观察。只是此法不易获得早期花粉细胞。采用此法,分别设酶解时间梯度和标记液浓度梯度来摸索最佳标记条件,结果表明:标记微丝以酶解15～30min为宜,标记微管以酶解0.5～1h为宜;适当降低标记液浓度可使标记效果更好。（3）冰冻切片法:固定小花后,进行冰冻包埋,冷冻后切片,真空粘片后脱包埋剂再进行标记。此技术克服了以上两种方法存在的问题,可以方便快捷地获得各时期的花药结构,DAPI染核效果很好,但是荧光标记效果不太理想,药壁组织细胞荧光信号很强,无法分辨花粉中微丝和微管的特异性荧光。结果表明,粘片法和研磨—离心法虽各有优缺点,但可以用于微丝和微管的荧光标记,观察花粉发育中细胞骨架的动态变化,可以将两种方法结合起来使用,采用粘片法标记早期花粉细胞,采用研磨—离心法标记后期花粉细胞。

论文目录

• 摘要
• Abstracts
• 2+的分布与花粉育性的关系'>第一章 光敏核不育水稻花药中Ca²⁺的分布与花粉育性的关系
• 1 前言
• 1.1 课题的提出
• 2+在植物细胞中的存在形式、分布及生理功能'>1.2 Ca²⁺在植物细胞中的存在形式、分布及生理功能
• 2+的分布及功能概述'>1.3 花药发育过程中Ca²⁺的分布及功能概述
• 2+分布与花粉壁的形成'>1.3.1 花粉表面Ca²⁺分布与花粉壁的形成
• 2+与花粉发育的关系'>1.3.2 绒毡层发育及乌氏体表面Ca²⁺与花粉发育的关系
• 2+分布与花粉发育的关系'>1.3.3 药隔中Ca²⁺分布与花粉发育的关系
• 2+异常分布与花粉败育关系的研究概况'>1.4 花药中Ca²⁺异常分布与花粉败育关系的研究概况
• 2+的异常分布与花粉败育关系的研究'>1.4.1 花粉细胞质中Ca²⁺的异常分布与花粉败育关系的研究
• 2+异常分布与花粉败育的研究'>1.4.2 绒毡层异常解体及乌氏体表面Ca²⁺异常分布与花粉败育的研究
• 2+异常分布与花粉败育关系的研究'>1.4.3 药隔中Ca²⁺异常分布与花粉败育关系的研究
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 3 结果与分析
• 2+的分布'>3.1 小孢子形成和花粉发育过程中Ca²⁺的分布
• 2+的分布'>3.1.1 可育花药中Ca²⁺的分布
• 2+的分布'>3.1.2 不育花药中Ca²⁺的分布
• 2+的分布'>3.2 花药发育过程中药壁组织中Ca²⁺的分布
• 2+的分布'>3.2.1 可育花药药壁中Ca²⁺的分布
• 2+的分布'>3.2.2 不育花药药壁中Ca²⁺的分布
• 2+的分布'>3.3 花药发育过程中药隔组织中Ca²⁺的分布
• 2+分布'>3.3.1 可育花药药隔中的Ca²⁺分布
• 2+分布'>3.3.2 不育花药药隔中的Ca²⁺分布
• 4 讨论
• 2+的分布和运输'>4.1 可育花药发育过程中Ca²⁺的分布和运输
• 2+的异常分布与花粉败育的关系'>4.2 不育花药中Ca²⁺的异常分布与花粉败育的关系
• 图版和图版说明
• 第二章 水稻花粉发育过程中细胞骨架荧光标记体系的建立
• 1 前言
• 1.1 细胞骨架的结构与功能
• 1.1.1 细胞骨架的组成及功能
• 1.1.2 微丝的结构及功能
• 1.1.3 微管的结构及功能
• 1.2 细胞骨架结构及功能的研究进展
• 1.2.1 微丝、微管的发现及研究简史
• 1.2.2 细胞骨架在植物细胞中功能的研究概况
• 1.3 细胞骨架荧光标记体系的研究进展
• 1.3.1 花粉荧光标记的最初试材
• 1.3.2 花粉发育过程中细胞骨架的荧光观察
• 1.3.3 细胞骨架荧光观察的新进展
• 1.4 激光扫描共聚焦显微镜在荧光观察中的应用
• 1.5 课题的提出
• 2 材料和方法
• 2.1 几种试剂的配置
• 2.1.1 PEMS缓冲液的配置
• 2.1.2 固定液的配置
• 2.1.3 酶解液的配置
• 2.1.4 微丝标记液配置
• 2.2 采用不同方法获得花粉细胞
• 2.2.1 多聚赖氨酸粘片法
• 2.2.2 研磨—离心法
• 2.2.3 冰冻切片法
• 2.3 荧光标记最佳条件摸索
• 2.3.1 改善固定条件
• 2.3.2 调整酶解时间
• 2.3.3 改变荧光标记工作液浓度
• 2.4 激光扫描共聚焦显微镜荧光观察
• 2.4.1 DAPI染核观察小孢子形成
• 2.4.2 水稻花粉发育中微丝形态变化的荧光观察
• 3 结果与分析
• 3.1 试剂的配制
• 3.2 不同方法获得花粉细胞
• 3.2.1 多聚赖氨酸粘片法
• 3.2.2 研磨—离心法
• 3.2.3 冰冻切片法
• 3.3 荧光标记的最佳条件
• 3.3.1 良好的固定方法
• 3.3.2 合适的酶解时间
• 3.3.3 合理的荧光标记工作液浓度
• 3.4 采用激光扫描共聚焦显微镜观察荧光
• 3.4.1 DAPI染核观察小孢子形成
• 3.4.2 水稻花粉发育中微丝形态变化的荧光观察
• 4 讨论
• 4.1 有效获得花粉细胞的途径
• 4.2 完善实验条件获得最佳标记效果
• 4.3 激光扫描共聚焦显微镜在荧光观察中的应用
• 5 总结和展望
• 图版和图版说明
• 参考文献
• 致谢