吡格列酮通过抑制髓过氧化物酶保护高脂血症大鼠血管内皮功能

论文摘要

研究背景冠状动脉粥样硬化性心脏病是当今严重威胁人类生命的首敌,目前已成为影响国人寿命和老年人生存质量的重要疾病之一。高脂血症引起的血管内皮功能障碍是动脉粥样硬化形成的第一步,其主要机制包括一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,NOS）表达或活性的改变、与NOS激活相关的辅因子表达的改变、一氧化氮（nitric oxide,NO）大量生成但其生物利用度却大大降低等。其中,NO生物利用度降低,NO/cGMP/cGK信号转导通路受损被认为是最为重要的机制。NO由三种NOS（eNOS、nNOS和iNOS）催化L-精氨酸生成,生理状态时血管内皮的NO浓度（约0.1～100 nM）很低,其作用是通过cGMP-cGK途径介导血管平滑肌的舒张反应。在高脂血症时,由于炎症等因素导致iNOS激活,进而NO的生成明显升高至μM级浓度。由于此时血管局部存在有大量的超氧阴离子（˙O2ˉ）,高浓度的NO极易与˙O2ˉ反应生成非常活跃的过氧亚硝基（ONOOˉ）,后者具有很强的细胞毒作用。如果能够找到高脂血症时ONOOˉ产生的关键环节并将其阻断,无疑能够再通NO的生理途径,进而逆转血管内皮功能障碍。髓过氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）是存在于中性粒细胞、单核细胞中嗜天青颗粒内的一种氧化酶,炎症时被释放到细胞外,通过与过氧化氢（H2O2）作用,产生次氯酸等强氧化剂,进而造成邻近组织损伤,在动脉粥样硬化等多种疾病中发挥重要作用。有研究发现,高脂血症时MPO大量聚集在血管内皮下的基膜,推测这些MPO通过沉淀NO,引起血管内皮功能障碍;还有综述分析,由于MPO本身可以调节˙O2ˉ的生成和消耗,推测高脂血症时MPO也可能通过产生ONOOˉ降低NO的生物活性,引起血管内皮功能障碍。即,MPO很有可能是高脂血症时血管内皮功能障碍的关键环节之一,但这一推测需要进一步的研究证实。大量研究表明,过氧化物酶增殖体激活受体激动剂γ（Peroxisome proliferator-activated receptorγ, PPARγ）具有抗炎和改善血管内皮功能等作用,但其确切机制还不清楚。由于MPO是炎症反应主要因子之一,而且有研究报道,PPARγ激动剂在不同细胞可以调节MPO基因不同形式的表达。我们推测PPARγ激动剂是否通过调节MPO来改善高脂血症时血管内皮功能,进而延缓动脉粥样硬化的发生。目的1、验证我们以前的实验结果。即,高脂血症时,通过NO/cGMP/cGK信号通路受损导致血管内皮功能障碍;2、观察分析MPO是否通过改变血管NO/cGMP/cGK信号通路介导高脂血症内皮功能障碍;3、PPARγ激动剂吡格列酮（PIO）是否能够逆转高脂血症所导致的血管内皮功能障碍。如果可以,是否与调节血管MPO有关。第一部分MPO介导高脂血症诱导的大鼠血管内皮功能障碍1方法1.1动物及分组选用健康雄性Wistar大鼠32只,随机分为以下五组:①普通对照组（n=8）:仅喂普通饲料八周;②高脂血症组（n=8）:喂八周高脂饲料;③高脂血症+MPO抑制剂氨苯砜组（n=8）:喂八周高脂饲料,最后6天同时用氨苯砜腹腔注射;④高脂血症+溶剂对照组（n=8）:喂八周高脂饲料,后6天同时用DMSO腹腔注射。1.2指标测定本实验用试剂盒测定血清总胆固醇（CHO）,甘油三脂（TG）,低密度脂蛋白-胆固醇（LDL-CHO）水平;采用离体血管环实验检测血管内皮功能,以ACh诱导的血管舒张程度反映血管内皮功能的完整性;用MPO活性检测试剂盒测定血管组织MPO的活性,用硝酸盐/亚硝酸盐比色测定试剂盒检测血管组织中总一氧化氮（NOx）含量,用放射性免疫试剂盒测定cGMP含量。2结果2.1食源性大鼠高脂血症动物模型的建立高脂饮食8周后,高脂饮食大鼠血清CHO、TG、LDL-CHO水平显著高于高脂饮食之前以及同期普通饮食大鼠血脂水平（表1,表2）。2.2高脂血症致血管内皮功能障碍与正常对照组相比,高脂血症组大鼠胸主动脉环上10-9-10-5 mol/L ACh诱导血管舒张的logEC50显著升高,即EC50值显著降低（P<0.01,图2a）;同时,血管最大舒张程度明显降低（P<0.01,图1a、图1b、图2b）。给予10-10-10-6 mol/L累积浓度的SNP（一种外源性NO的供体）后,两组间的血管张力无明显差别。2.3高脂血症诱导的血管NO/cGMP/cGK信号转导通路受损2.3.1高脂血症大鼠血管的NO含量减少为了验证与高脂血症诱导的血管内皮功能障碍相关的信号转导途径,我们测定了血管组织的NOx含量。与正常对照组相比,高脂血症大鼠血管NOx含量明显降低（P<0.01,图4）。2.3.2高脂血症大鼠血管的cGMP含量降低本实验通过检测cGMP含量反映血管NO的生物活性。与正常对照组相比,高脂血症大鼠血管cGMP含量明显降低（P<0.01,图5）。以上结果提示,高脂血症时,NO/cGMP/cGK信号转导通路受损,NO的生物学活性降低,从而导致血管内皮功能障碍。2.4高脂血症大鼠血管MPO活性增高为了观察高脂血症时血管MPO的变化,我们检测了血管MPO活性。与正常对照组大鼠相比,高脂血症使大鼠血管MPO活性显著升高（P<0.01,图6）。2.5血管内皮功能与MPO活性呈负相关血管内皮功能与MPO的活性进行相关性分析结果显示,ACh诱导血管舒张的logEC50值与MPO活性呈正相关（r=0.797,P<0.01,图7）,即ACh诱导血管舒张的EC50值与MPO活性呈负相关;ACh诱导的血管最大舒张程度与MPO活性呈负相关（r=-0.883,P<0.01,图8）。2.6血管组织NOx和cGMP含量均与MPO活性呈负相关为了进一步证实MPO是否与高脂血症诱导的血管NO/cGMP/cGK信号转导途径受损的相关,对血管组织NOx和cGMP含量与MPO的活性进行相关性分析。结果表明,血管组织NOx和cGMP含量均与MPO活性呈负相关,其r值分别为-0.768（P<0.01,图9）和-0.955（P<0.01,图10）。说明,高脂血症时血管MPO活性升高与血管NO/cGMP/cGK信号转导途径受损及血管内皮功能障碍相关。2.7 MPO抑制剂—氨苯砜降低高脂血症大鼠血管组织MPO活性为了进一步探讨MPO在高脂血症诱导的内皮功能障碍中的作用,我们给予高脂血症大鼠MPO的抑制剂—氨苯砜。用MPO抑制剂氨苯砜干预后,高脂血症大鼠血管MPO活性明显降低（P<0.01）,而溶剂DMSO对高脂血症大鼠血管MPO活性无明显影响（图11）。2.8氨苯砜干预后,高脂血症诱导的血管内皮功能障碍减轻与高脂对照组相比,用氨苯砜干预后,ACh诱导的血管舒张的logEC50明显降低（P<0.01,图12a）;同时,血管最大舒张程度明显增高（P<0.01,图12b、图14a）。用DMSO干预后,ACh诱导的血管最大舒张程度增高（P<0.01,图12b）,而两组间logEC50值却无明显差异（图12a）。ACh诱导的血管最大舒张程度在氨苯砜组和溶剂对照组间有明显差异（P<0.01）。在给予10-10mol/L-10-6 mol/L累积浓度的SNP后,血管张力在各组间无明显差别（图13、图14b）。2.9氨苯砜干预后,改善高脂血症诱导的血管NO/cGMP/cGK信号转导通路损伤2.9.1氨苯砜干预后,高脂血症大鼠血管NO含量升高为了探讨与MPO介导的高脂血症诱导的血管内皮功能障碍的作用机制,我们测定了氨苯砜干预后血管组织的NOx含量。与高脂血症组相比,用MPO抑制剂氨苯砜干预后,高脂血症大鼠血管NOx含量明显回升（P<0.01）,而溶剂DMSO干预组其血管NOx含量无明显改变（图15）。2.9.2氨苯砜干预后,高脂血症大鼠血管的cGMP含量升高MPO抑制剂氨苯砜干预可以使高脂血症大鼠血管cGMP水平明显升高（P<0.01）,而溶剂DMSO对血管cGMP水平无明显影响。提示,高脂血症可能通过MPO降低血管NO的生物学活性。以上结果提示,高脂血症时血管MPO活性增高,进而使血管NO/cGMP/cGK信号转导通路受损,导致血管内皮功能障碍。第二部分吡格列酮通过抑制髓过氧化物酶改善高脂血症大鼠血管内皮功能障碍1方法1.1动物及分组选用健康雄性Wistar大鼠32只,随机分为以下五组:①普通对照组（n=8）:仅喂普通饲料八周;②高脂血症组（n=8）:喂八周高脂饲料,后四周同时用色拉油（溶剂）灌胃;③高脂血症+吡格列酮组（n=8）:喂八周高脂饲料,后四周同时用吡格列酮灌胃;④高脂血症+氨苯砜组（n=8）:喂八周高脂饲料,后四周同时用色拉油（溶剂）灌胃,最后6天同时用氨苯砜腹腔注射;⑤高脂血症+吡格列酮+氨苯砜组（n=8）:喂八周高脂饲料,后四周同时用吡格列酮灌胃,最后6天同时用氨苯砜腹腔注射。1.2指标测定同第一部分。2结果2.1食源性大鼠高脂血症动物模型的建立给予高脂饲料前,大鼠的血脂水平无明显差异（表1）。高脂饮食4周后,大鼠血脂水平较四周前显著提高,高脂饮食大鼠血清CHO、TG、LDL-CHO水平显著高于同期普通饮食大鼠血脂水平（表3）。用吡格列酮干预（灌胃4周）后,高脂血症大鼠血脂水平明显下降（表4、图17、图18）。2.2吡格列酮干预后,高脂血症诱导的血管内皮功能障碍减轻与高脂血症组相比,用吡格列酮干预后,ACh诱导logEC50明显降低（P<0.05,图19a）;同时,血管最大舒张程度显著增加（P<0.01,图19b、图21a）。各组间SNP诱导的血管舒张无明显差异（图20、图21b）。吡格列酮干预后高脂血症大鼠ACh诱导的血管舒张与用MPO抑制剂氨苯砜干预后ACh诱导的血管舒张无明显差异,高脂血症大鼠用吡格列酮和氨苯砜同时干预后,其ACh诱导的血管舒张与单纯用吡格列酮干预后的血管舒张无明显差异（图19a、图19b、图21a）。2.3吡格列酮干预后,高脂血症大鼠血管组织MPO活性降低吡格列酮干预后,高脂大鼠血管MPO活性显著降低（P<0.01）,且与氨苯砜干预后的大鼠血管MPO活性无明显差异（图22）。2.4吡格列酮干预后,高脂血症大鼠血管内皮功能与MPO活性呈负相关为了进一步证实MPO在吡格列酮保护高脂血症血管内皮功能中的作用,对吡格列酮干预后各组血管内皮功能与MPO的活性进行相关性分析。结果显示,ACh诱导血管舒张的logEC50值与MPO活性呈正相关（P<0.01,图23）,即ACh诱导血管舒张的EC50值与MPO活性呈负相关;同时,ACh诱导的血管最大舒张程度与MPO活性呈负相关（P<0.01,图24）。吡格列酮干预后,高脂血症大鼠血管MPO活性降低的同时血管内皮功能改善,进一步提示吡格列酮通过抑制MPO,保护高脂血症大鼠血管内皮功能。2.5吡格列酮干预后,改善高脂血症诱导的血管NO/cGMP/cGK信号转导通路损伤2.5.1吡格列酮干预后,高脂血症大鼠血管NO含量升高为了探讨MPO在吡格列酮对高脂血症大鼠血管内皮保护机制中的作用,本实验测定了血管组织中重要的信号分子NO（NOx）的含量。吡格列酮干预后,高脂血症大鼠血管NOx水平回升（P<0.05）,且与MPO抑制剂氨苯砜干预组的血管NOx水平无明显差异（图25）。2.5.2吡格列酮干预后,高脂血症大鼠血管cGMP的含量升高吡格列酮干预可以使高脂血症大鼠血管cGMP水平回升（P<0.01）,与氨苯砜干预后血管cGMP水平相比无明显差异（图26）。以上结果提示,吡格列酮能够改善高脂血症诱导的血管NO/cGMP/cGK信号转导通路的损伤,且吡格列酮可能通过抑制MPO发挥这种保护作用。2.6吡格列酮干预后,高脂血症大鼠血管组织NOx和cGMP含量均与MPO活性呈负相关为了进一步证实MPO与吡格列酮逆转高脂血症诱导的血管NO/cGMP/cGK信号转导途径受损的直接相关性,对吡格列酮干预后各组血管组织NOx和cGMP含量与MPO的活性进行相关性分析。结果表明,用吡格列酮干预后血管组织NOx和cGMP含量均与MPO活性呈负相关,其r值分别为-0.748（P<0.01,图27）和-0.899（P<0.01,图28）。以上结果提示,吡格列酮可能通过抑制MPO保护血管内皮NO/cGMP/cGK信号转导通路,进而改善高脂血症大鼠血管内皮功能。结论1、MPO通过减少血管NO的生成和/或降低NO生物活性,损伤NO/cGMP/cGK信号转导通路,而参与高脂血症诱发的内皮功能障碍;2、PPARγ激动剂吡格列酮可能通过抑制血管MPO的活性逆转高脂血症所致的内皮功能障碍。

论文目录

• 中文摘要
• 第一部分 MPO 介导高脂血症诱导的大鼠血管内皮功能障碍
• 第二部分 吡格列酮通过调节髓过氧化物酶改善高脂血症大鼠血管内皮功能
• 英文摘要
• Part1 MPO mediates endothelial dysfunction in rats with hypercholesterolemia
• Part2 Pioglitazone protects endothelial function in hypercholesterolemic rats by regulating vascular MPO activity
• 前言
• 第一部分 髓过氧化物酶介导高脂血症诱导的大鼠血管内皮功能障碍
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 第二部分 吡格列酮通过调节髓过氧化物酶改善高脂血症大鼠血管内皮功能障碍
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附图表
• 综述
• 个人简介
• 致谢