糜子干旱复水的基因表达谱分析及相关基因克隆

论文摘要

水资源短缺是全球性的焦点问题之一。在世界范围内,干旱对作物生产造成的影响越来越大,解决这一问题的有效途径是培育抗旱品种。而经过多年的选育过程,主要作物本身的抗旱资源已经利用殆尽,利用现有的具有水分高效利用特性的植物基因资源对作物的抗旱性进行改良是一种较好的选择。植物在生长过程中经常会经历不同季节、不同生育期的干湿变化,植物的抗旱性不仅体现在对干旱状态的耐受程度上,还应包括胁迫状态解除后的恢复能力。因此植物干旱后复水机理的研究同样对作物抗旱性的改良具有重要的意义。糜子是起源于我国的一种古老作物,现在仍是我国干旱半干旱地区的主要粮食作物之一。糜子具有耐旱、抗逆、水分利用效率高等特点,是小麦、玉米及水稻等大宗作物水分利用效率改良的优异基因资源。糜子抗旱性的机理研究多集中在生理生化方面,而在分子水平上的研究未见报道。为了挖掘和利用糜子水分高效利用的基因资源,本研究利用cDNA-AFLP及抑制性消减杂交技术（SSH）对糜子在干旱及复水状态下特异表达的基因进行了差异表达分析,重点是分析复水诱导表达的基因,同时对部分差异表达序列进行半定量RT-PCR验证和全长序列扩增,得到的主要结果如下:1.利用cDNA-AFLP对糜子正常生长、干旱处理及复水处理条件下的幼苗叶片进行了差异显示,试验共选取了36个引物组合（6个荧光标记的TaqⅠ引物×6个非荧光标记的MseⅠ引物）进行选择性扩增,这些引物组合在三种处理之间均能扩增出表达模式不同的差异片段。对部分引物组合的统计结果表明,在三种处理样品中扩增的总条带数多少依次为:对照>复水>干旱,表明在干旱条件下糜子基因的表达受到一定程度的抑制,但是经复水后,基因转录又变得较为活跃,植株逐渐恢复正常生长。随机选取了8个干旱特有和4个复水特有的差异片段进行了克隆测序。用Blastx与Genbank的非冗余蛋白数据库进行比较结果表明,其中两个序列（DR007249,DR007250）与水稻的反转录转座子蛋白具有较高的同源性;一个序列（DR007245）与N-乙酰葡萄糖胺-N-乙酰胞壁酸五肽的同源性较高;另外还有两个序列（DR007251,DR007252）与两种假定蛋白同源性较高;其余序列无同源性较高的蛋白序列。2.为了揭示糜子干旱复水相关基因的表达模式,以复水处理的叶片cDNA为tester,以正常浇水的叶片cDNA为driver构建了复水-对照（即RC文库,R-rehydration,C-check）抑制削减杂交文库;以复水处理的叶片cDNA为tester,以干旱处理叶片cDNA为driver构建了复水-干旱抑制消减杂交文库（即RS文库,R-rehydration,S-stress）。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 干旱胁迫的信号传导
• 1.1.1 主要信号传导物质
• 1.1.2 信号传导途径
• 1.2 植物干旱胁迫下诱导的基因表达
• 1.2.1 参与干旱胁迫下基因表达的转录因子
• 1.2.2 干旱胁迫下诱导的基因表达途径
• 1.2.3 干旱胁迫下诱导的功能蛋白
• 1.3 植物干旱后复水机制的研究进展
• 1.3.1 植物胁迫后的补偿效应
• 1.3.2 干旱后复水补偿效应产生的机制
• 1.3.3 干旱后复水补偿效应的类型
• 1.3.4 作物补偿效应的影响因素
• 1.3.5 作物补偿效应分子机理研究
• 1.4 功能基因组学及其在植物抗逆性研究中的应用
• 1.4.1 基因差异表达的主要研究方法
• 1.4.2 基因功能验证的主要方法
• 1.5 糜子抗旱性研究现状
• 1.6 本研究的目的与意义
• 1.7 技术路线与预期成果
• 第二章 糜子干旱及复水相关基因cDNA-AFLP 差异显示
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 总RNA的提取与DNaseⅠ处理
• 2.1.3 双链cDNA 的合成及纯化
• 2.1.4 cDNA-AFLP反应与程序
• 2.1.5 差异片段的聚丙烯酰胺凝胶回收与再扩增
• 2.1.6 再扩增产物琼脂糖凝胶回收
• 2.1.7 差异片段的克隆、转化与测序
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 糜子叶片对照及干旱胁迫下基因差异表达谱
• 2.2.2 部分差异条带的序列分析
• 2.3 讨论
• 第三章 糜子干旱后复水抑制消减杂交文库的构建及文库质量检测
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 总RNA提取及DNase I 处理
• 3.1.3 cDNA 文库的构建
• 3.1.4 消减杂交效率检测
• 3.1.5 PCR产物的克隆、转化与鉴定
• 3.1.6 质粒提取
• 3.1.7 质粒的 EcoRⅠ酶切鉴定
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 总 RNA 质量检测
• 3.2.2 cDNA 消减杂交和抑制性PCR 效果检测
• 3.2.3 消减杂交效率检测
• 3.2.4 阳性克隆的筛选与鉴定
• 3.2.5 阳性克隆的质粒及酶切检测
• 3.3 讨论
• 第四章 糜子复水相关基因片段的生物信息学分析及表达谱的初步建立
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 SSH 文库的构建与差异片段的获得
• 4.1.3 差异片段的序列测定
• 4.1.4 差异表达序列的生物信息学分析
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 序列测定
• 4.2.2 序列的重叠群分析及比对结果统计
• 4.2.3 RC 文库的序列比对结果分析
• 4.2.4 RS 文库的序列比对结果分析
• 4.2.5 两个复水相关文库的比较分析
• 4.3 讨论
• 4.3.1 关于复水文库的构建
• 4.3.2 干旱后复水的信号传导
• 4.3.3 功能基因在复水中的作用
• 4.3.4 细胞的防卫与保护机制
• 4.3.5 植物对环境胁迫的交叉适应
• 第五章 部分差异片段的半定量 RT-PCR 验证
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 糜子总RNA 的提取及痕量DNA 的去除
• 5.1.3 cDNA 第一链的合成
• 5.1.4 RT-PCR 所用引物、反应体系及程序
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 模板浓度的确定
• 5.2.2 不同基因的表达模式分析
• 5.3 讨论
• 第六章 糜子抗逆相关基因全长cDNA 序列的克隆与结构分析
• 6.1 材料和方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 糜子叶片 DNA 的提取
• 6.1.3 糜子叶片总 RNA 的提取
• 6.1.4 cDNA 第一链的合成
• 6.1.5 基因组PCR 或RT-PCR 引物序列及反应温度
• 6.1.6 基因组PCR 或RT-PCR 反应体系及程序
• 6.1.7 目的片段的克隆与测序
• 6.1.8 序列生物信息学分析软件及网站
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 糜子GTP 结合蛋白基因的克隆与分析
• 6.2.2 糜子 MYB 家族转录因子基因的克隆与分析
• 6.2.3 糜子 S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆与分析
• 6.2.4 糜子 Suil 蛋白翻译因子的克隆与分析
• 6.2.5 糜子泛素家族蛋白基因的克隆与分析
• 6.3 讨论
• 6.3.1 GTP 结合蛋白在信号传导中的作用
• 6.3.2 MYB 家族转录因子
• 6.3.3 S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因
• 6.3.4 SUI1 翻译起始因子
• 6.3.5 泛素家族基因
• 第七章 结论
• 参考文献
• 附录
• 缩略词与英汉对照
• 致谢
• 作者简介