论文摘要
本课题从C57BL/6J小鼠的胸腺组织通过RT-PCR法获得Ipr1 （intracellular pathogen resistance 1,细胞内病原体抗性基因1）基因全长编码序列,克隆入真核表达载体,体外转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞,并在转录水平及翻译水平鉴定了Ipr1基因的表达,并确定了Ipr1基因表达产物的细胞内定位。观察了Ipr1基因的表达对巨噬细胞生长状态的影响及巨噬细胞体外抗分枝杆菌H37Ra感染活性的影响。运用基因芯片技术检测Ipr1基因的表达与巨噬细胞抗Mtb感染的免疫应答机制中的相关因素之间相互关系,初步探讨了Ipr1基因在巨噬细胞抗Mtb感染中的作用机制。第一部分Ipr1基因的获取及原核表达载体的构建和表达目的:获取Ipr1基因全长编码序列,构建Ipr1基因原核表达载体,转化大肠杆菌,诱导重组蛋白表达,制备抗Ipr1多克隆抗体。方法:从C57BL/6J小鼠胸腺组织提取总RNA,以RT-PCR法调取Ipr1基因编码序列,上下游引入BamHⅠ、PstⅠ酶切位点,克隆至pMD19-T simple载体中获得重组质粒pMD19-T simple-Ipr1,转化大肠杆菌JM109,筛选的阳性克隆作PCR及酶切鉴定后测序分析。其中的突变碱基经点突变修复,测序正确后获得含正确Ipr1序列的重组质粒*pMD19-T simple-Ipr1。将Ipr1基因亚克隆于原核表达载体pQE30,获得原核表达质粒pQE30-Ipr1;以重组质粒*pMD19-T simple-Ipr1为模板,PCR法扩增Ipr1基因,上下游分别引入KpnⅠ、BamHⅠ酶切位点,构建另一原核表达质粒pET32a（+）-Ipr1。将pQE30-Ipr1转化表达菌株SG13009、M15;pET32a（+）-Ipr1转化表达菌株BL21、BL21（pLyS）,IPTG诱导目的基因的表达,SDS-PAGE鉴定重组蛋白表达情况。结果:从C57BL/6J小鼠胸腺组织内扩增出大小为1338bp片段。阳性克隆测序鉴定发现一个点突变,经点突变修复后与GenBank报道的Ipr1基因序列一致。亚克隆获得重组原核表达质粒pQE30-Ipr1经酶切鉴定正确,构建的另一原核表达质粒pET32a（+）-Ipr1经测序鉴定正确。pQE30-Ipr1、pET32a（+）-Ipr1分别在其相应表达菌株IPTG诱导表达,均未成功表达出Ipr1重组蛋白。结论:成功获取小鼠Ipr1基因全长编码序列并成功构建含Ipr1基因的两种原核表达质粒pQE30-Ipr1、pET32a（+）-Ipr1,但Ipr1基因原核表达获取重组蛋白未获成功,提示Ipr1基因原核表达可能有一定难度。第二部分Ipr1基因真核表达载体构建及细胞内表达鉴定和定位目的:构建小鼠Ipr1基因与EGFP基因融合表达载体,鉴定Ipr1基因在小鼠巨噬细胞株RAW264.7中的表达及细胞内定位。方法:限制性内切酶KpnⅠ、BamHⅠ双酶切重组原核表达质粒pET32a（+）-Ipr1及真核表达载体pEGFP-C1,获得的Ipr1基因片段与pEGFP-C1载体大片段连接后获得真核表达质粒pEGFP-Ipr1,经PCR、酶切鉴定正确后,脂质体瞬时转染pEGFP-Ipr1至小鼠巨噬细胞株RAW264.7,以空质粒pEGFP-C1转染组作为对照。采用RT-PCR法、Western blotting法分别在转录水平及翻译水平检测Ipr1基因的表达及用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的表达及细胞内定位。结果:成功构建了重组真核表达质粒pEGFP-Ipr1,瞬时转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7,经RT-PCR、Western-blotting鉴定Ipr1基因在转录水平及翻译水平获得表达,Ipr1基因编码产物分子量大约50kD左右,荧光显微镜及共聚焦显微镜观察Ipr1融合绿色荧光蛋白表达产物定位于细胞核内。结论:成功构建了Ipr1基因与EGFP基因融合表达质粒pEGFP-Ipr1,成功转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7,在转录及翻译水平检测到Ipr1基因表达,Ipr1基因表达产物定位于细胞核内。第三部分Ipr1基因表达对小鼠巨噬细胞株RAW264.7生长的影响及杀伤分枝杆菌作用的研究目的:观察Ipr1基因表达对小鼠巨噬细胞株RAW264.7的生长状态的影响,以及Ipr1基因的表达对小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞体外杀伤结核分枝杆菌H37Ra作用的影响。方法:1.采用脂质体瞬时转染的方法将Ipr1基因真核表达质粒pEGFP-Ipr1转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞,同时转染空质粒pEGFP-C1作为对照组,应用MTT法检测Ipr1基因的表达对巨噬细胞的生长是否有抑制作用;应用TUNEL原位凋亡检测Ipr1基因表达对巨噬细胞是否有致凋亡作用。2.应用G418压力筛选稳定表达Ipr1基因的小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞,获得高表达Ipr1基因的巨噬细胞（实验组细胞）,同时筛选空质粒pEGFP-C1转染稳定表达GFP的细胞（对照组细胞）。3.体外感染分枝杆菌H37Ra,感染后24h及96h细胞裂解物细菌培养菌落计数（CFU）的方法观察实验组细胞（Ipr1+）、对照组细胞（Ipr1-）抗结核分枝杆菌H37Ra感染活性。结果:1.MTT法检测未发现Ipr1基因的表达对小鼠巨噬细胞株RAW264.7有抑制生长的作用;TUNEL原位凋亡检测结果未发现Ipr1基因的表达对小鼠巨噬细胞株RAW264.7有促凋亡的作用。2.经G418压力筛选后获得稳定表达Ipr1基因的RAW264.细胞及空GFP表达的RAW264.细胞。3.细胞水平抗分枝杆菌H37Ra实验结果显示Ipr1基因的表达的实验组巨噬细胞裂解物细菌培养菌落计数（CFU）低于对照组细胞,差异具有统计学意义（p<0.05）。结论:Ipr1基因的表达产物对巨噬细胞的增殖无抑制作用,也不引起巨噬细胞凋亡。G418压力筛选出高表达Ipr1基因的细胞。体外抗菌实验表明Ipr1基因的表达增强了巨噬细胞杀伤胞内吞噬的结核分枝杆菌H37Ra的能力。第四部分基因芯片初步探讨Ipr1基因的表达对巨噬细胞结核抗分枝杆菌感染免疫应答的影响目的:应用小鼠固有免疫及适应性免疫应答功能分类cDNA芯片检测Ipr1基因在巨噬细胞的表达对感染结核分枝杆菌H37Ra的巨噬细胞抗感染免疫应答相关机制的影响及相互关系。方法:实验组（Ipr1+）巨噬细胞RAW264.7与对照组（Ipr1-）巨噬细胞RAW264.7分别感染结核分枝杆菌H37Ra,于感染96h后分别提取两组的总RNA,逆转录合成cDNA及线性生物素标记的cRNA,纯化cRNA后与小鼠固有免疫及适应性免疫应答功能分类基因芯片（113个基因位点）杂交,应用化学发光检测基因芯片杂交结果,采集图像经软件分析得到基因表达差异的结果。应用实时定量PCR法对芯片结果中上调的3个基因检测以验证芯片结果的可靠性。结果:基因芯片结果经数据分析发现Ipr1基因的表达上调了11个巨噬细胞抗Mtb固有免疫机制中的有关分子的基因转录,其中与巨噬细胞抗Mbt感染关系密切的基因有:参与TLRs信号通路的分子:TLR2、TLR4、Irak1、Traf6,以及干扰素相关基因:Ifngr1（IFN-γR1）和肿瘤坏死因子相关基因:Tnfrsf1a（TNFR1）。而巨噬细胞参与调节适应性免疫应答相关的分子的基因表达如:IL-1、TNF-α、IL-12等表达无明显差异。对于3个表达下调的基因Clecsf12、Il1rap、Ltf由于其标准值较低（<0.05）,其准确度较低,可能意义不大。经定量PCR反应对TLR2、TLR4及Ifngr1的检测结果与芯片结果分析表明定量PCR结果与芯片结果趋势一致。结论:通过对基因芯片结果的分析,我们初步推测,Ipr1基因的表达可能主要是增强巨噬细胞抗Mtb感染固有免疫机制的有关基因的表达,特别是TLR2/TLR4及与其信号转导有关的分子以及IFN-γR1、TNFR1的表达,促进巨噬细胞的活化及杀伤胞内吞噬的Mtb,发挥抗菌作用。为下一步研究Ipr1基因作用的分子机制及作用位点提供了重要的参考依据。