力达霉素对神经胶质瘤抑制作用及联合替莫唑胺的协同作用研究

论文摘要

神经胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤,是高度血管化的血管生成依赖性生长的人类肿瘤。目前的报道表明神经胶质瘤的血管微环境在神经胶质瘤发生与发展、侵袭、临床诊断及治疗效果中起关健性作用。肿瘤微环境已经成为化疗的靶标之一。尽管神经胶质瘤的治疗已经取得了很多进步,中枢神经系统肿瘤患者的预后及诊断仍然很不理想,死亡率仍然很高。新的治疗策略仍然有待研究。力达霉素（Lidamycin,LDM,C-1027）是烯二炔类抗生素家族的一个成员,它具有很强的细胞毒性、抗血管生成活性及抑制实验肿瘤生长的作用,力达霉素已经在中国进入了临床研究。为测试力达霉素对神经胶质瘤的作用及机制,我们对力达霉素作用于大鼠神经胶质瘤C6细胞和人神经胶质瘤U87细胞后的效应进行了检测,以揭示其抑制神经胶质瘤的效果。替莫唑胺（Temozolomide,TMZ）是目前治疗恶性神经胶质瘤的有效药物,临床前研究与临床研究已经证实了替莫唑胺具有很强的抗血管生成活性及抑制肿瘤生长的作用,它能够显著提高肿瘤患者的生存率。替莫唑胺与其他类药物联合治疗神经胶质瘤已经取得了更为有效的结果,替莫唑胺新的联合治疗方法已经受到了科研工作者的高度重视。本研究探索力达霉素与替莫唑胺对神经胶质瘤的体外与体内作用,以期应用于神经胶质瘤的治疗。1.LDM对神经胶质瘤细胞的影响及与TMZ联合的效果。MTT分析表明,LDM(10-7/mol/L～1014mol/L)能够显著抑制大鼠神经胶质瘤C6细胞和人神经胶质瘤U87细胞增殖,其IC50值分别为5.86×10-11mol/L和2.05×10-11mol/L。LDM(10-10mol/L～10-14 mol/L)与TMZ（60μmol/L,90μmol/L,120μmol/L,150μmol/L）联合处理72小时对神经胶质瘤细胞和大鼠脑微血管内皮细胞的增殖抑制存在着协同作用。Annexin V-FITC/PI双染结合流式细胞仪结果表明LDM（0.1 nmol/L,0.5 n mol/L,1 n mol/L）以剂量依赖方式诱导细胞凋亡。LDM与TMZ联合能够显著增强神经胶质瘤C6和U87细胞的凋亡率,这与Western blot结果提示两药联合协同增强了P53凋亡途径的调节有关。2.LDM对体外模拟肿瘤微环境的影响及与TMZ联合效果LDM单药（0.1 nmol/L,0.5 nmol/L,1 nmol/L）能够以剂量依赖方式显著抑制大鼠脑微血管内皮细胞的侵袭。LDM（0.1 nmol/L）与TMZ（200μmol/L）联合用药后,侵袭细胞数明显的减少,与单独用药组比较,P值均小于0.001,二者存在明显的协同作用,协同指数为0.68。蛋白印迹的结果表明LDM与TMZ联合抑制大鼠脑微血管内皮细胞的侵袭与其抑制VEGFR2活性及基质金属蛋白酶MMP2和MMP9的表达有关。以不同药物组合处理大鼠神经胶质瘤C6细胞和大鼠脑微血管内皮细胞rBMEC的共培养系统72小时后,与对照组比较,大鼠脑微血管内皮细胞的迁移受到了药物处理的显著抑制,联合处理组的迁移细胞数受到更为明显的抑制,与单独用药组比较,P值均小于0.001,联合指数为0.72,ELISA方法与蛋白印迹实验结果一致表明这与大鼠神经胶质瘤C6细胞条件培养基中VEGF的表达受到药物联合处理的明显抑制有关,也与大鼠脑微血管内皮细胞VEGFR的活性和神经胶质瘤C6细胞和U87细胞VEGF的表达受到协同抑制有关。3.LDM对大鼠脑微血管内皮细胞和体外血管生成的影响及与TMZ联合效果LDM对大鼠脑微血管内皮细胞的增殖有强烈的抑制作用,其IC50值为1.06×10-11mol/L,同时也存在着剂量依赖性诱导内皮细胞凋亡作用。LDM与TMZ联合后可增强细胞毒作用及诱导细胞凋亡作用。LDM可以阻断内皮细胞形成的小管,并随着剂量加大,破坏小管的能力越强。LDM 0.1 nmol/L与TMZ 200μmol/L联合处理内皮细胞,形成的管状结构要比LDM 0.1 nmol/L组少,P＜0.01,与TMZ 200μmol/L相比较,P＜0.001,二者的联合指数为0.75。LDM 0.1 nmol/L或TMZ 200μmol/L作用于大鼠动脉环后,都显示了明显的抑制作用,二者联合后能够更为明显的抑制动脉环发芽,与单独用药组比较P值均小于0.001,联合指数为0.8。4.LDM与TMZ联合对人神经胶质瘤U87裸鼠移植瘤生长抑制LDM 0.025mg/kg和0.05mg/kg能够显著抑制人神经胶质瘤U87裸鼠移植瘤的生长,TMZ也能够显著抑制肿瘤人神经胶质瘤的生长,与对照组相比较,P值均小于0.001。各药物处理组对动物体重都没有明显的影响。肿瘤生长曲线和瘤重量分析结果显示,LDM与TMZ单药能够产生抑制肿瘤生长的效果,LDM 0.025mg/kg和0.05mg/kg分别与TMZ 0.5mg/kg联合能够更为显著的抑制肿瘤的生长,联合指数小于1,表明二者能够协同抑制神经胶质瘤的生长。经原位TUNEL检测,LDM单药能够诱导细胞凋亡,且随着剂量加大,凋亡率也增加。LDM与TMZ 0.5 mg/kg联合后可明显的增加凋亡率,与单独用药组比较P值均小于0.001,LDM 0.025mg/kg和0.05mg/kg与TMZ联合的协同指数分别为0.75和0.77,表明二者在体内协同诱导细胞凋亡。CD31的免疫组织化学分析表明,LDM单药、TMZ单药及二者联合都能够降低人神经胶质瘤U87裸鼠移植瘤血管密度,与对照组相比较均存在显著性差异。二者联合能够更为显著的抑制肿瘤组织的血管生成,LDM 0.025mg/kg和0.05mg/kg分别与TMZ 0.5mg/kg联合后,其抑制肿瘤血管生成的协同指数分别为0.88和0.78,表明二者能够协同抑制肿瘤血管生成。同时,VEGF的免疫组织化学分析表明,LDM与TMZ联合对肿瘤组织中VEGF的表达也产生协同抑制作用,LDM 0.025mg/kg与TMZ0.5mg/kg的协同指数为0.93;LDM 0.05mg/kg与TMZ 0.5mg/kg抑制VEGF表达的协同指数为0.42。本研究工作采用MTT法分析了药物对神经胶质瘤细胞和脑微血管内皮细胞增殖的影响,采用Annexin V-FITC/PI法检测了药物处理后细胞凋亡,同时,为了更全面的反映神经胶质瘤血管微环境,从肿瘤旁分泌网络考虑,采用共培养系统观察了药物对大鼠神经胶质瘤C6细胞和大鼠脑微血管内皮细胞相互作用的影响,包括细胞迁移和VEGF的分泌。以大鼠脑微血管内皮细胞的小管形成实验和大鼠动脉环实验作为体外血管生成的模型,来分析药物对血管生成的影响。体内实验中,在分析了力达霉素与替莫唑胺联合对肿瘤生长的影响,同时也分析了二者联合对细胞凋亡和微血管密度及VEGF表达的影响。我们的工作证明:力达霉素强烈抑制神经胶质瘤的细胞增殖和诱导神经胶质瘤细胞凋亡,并抑制血管生成,同时力达霉素可以与替莫唑胺联合作用,协同抑制神经胶质瘤的生长,增加细胞凋亡诱导及增加对VEGF表达的抑制。

论文目录

• 缩略语
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 材料与方法
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 2.1 细胞的传代、冻存和复苏
• 2.2 大鼠脑微血管内皮细胞的分离与培养
• 2.3 MTT法测定细胞存活率
• 2.4 Annexin V-FITC/PI染色结合流式细胞仪检测细胞凋亡
• 2.5 Transwell实验检测大鼠脑微血管内皮细胞（rBMEC）的侵袭
• 2.6 Transwell共培养实验检测大鼠脑微血管内皮细胞（rBMEC）的迁移
• 2.7 大鼠脑微血管内皮的小管形成（Tube formation）实验
• 2.8 大鼠动脉环（rat aortic ring）实验
• 2.9 蛋白免疫印迹（Western blot）实验
• 2.10 体内抗肿瘤实验
• 3 两药联合指数的计算
• 4 统计学处理
• 实验结果
• 1.LDM抑制神经胶质瘤细胞增殖及诱导细胞凋亡及与TMZ联合作用
• 2.LDM抑制共培养肿瘤微环境细胞功能及与TMZ协同作用
• 3.LDM抑制内皮细胞增殖、诱导凋亡、抑制血管生成及与TMZ协同
• 4.LDM抑制人神经胶质瘤U87裸鼠移植瘤生长及与TMZ协同作用
• 5.LDM与TMZ联合效果评价
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述:肿瘤干细胞及肿瘤治疗
• 致谢