实验性急性肺损伤肺修复策略与生命支持的研究

论文摘要

前言急性肺损伤（ALI）和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是多种原因引起的急性呼吸衰竭，是危及各个年龄段的临床危重症，在儿科重症监护病房（PICU）中病死率很高。近年来随着肺保护性通气策略的应用，国外ARDS的病死率有较大幅度的下降，但仍有30-40％的ARDS患者预后不良。研究发现，在ARDS早期就存在纤维母细胞增生和胶原合成，表明炎症损伤与失常的修复过程是同时进行的。如果能有效干预阻断肺内炎症反应，促进肺组织上皮细胞继续遵循发育规律实现良性修复性增殖，避免胶原沉积、肺纤维化的重塑性增殖，通过结构与功能重建，必将改善ARDS预后。利用干细胞移植来修复受损组织是近年来的研究热点，多项研究发现骨髓来源的干细胞能迁移至肺，在某种特定环境下通过横向分化、细胞融合等机制，生成肺泡上皮细胞、血管内皮细胞，可能减轻肺炎症损伤，修复受损肺结构。ARDS最重要治疗手段为机械通气，但是机械通气相关性肺损伤可进一步加剧肺上皮细胞、血管内皮损伤。严重的炎症反应使肺泡上皮修复性增殖过程紊乱，重塑性增殖加剧，导致胶原沉积、肺纤维化和治疗失败。当常规方法对这类患者进行治疗病情无改善时，体外膜肺（ECMO）技术可作为ARDS的最终治疗手段，它能提供有效氧合和气体交换作为生命支持，并通过缓和呼吸机通气及氧疗对肺部的潜在医源性伤害，从而最低限度地干预肺，使肺得到休息，从而完成功能上的改善和病理上的修复。综上所述，我们从骨髓基质细胞移植和ECMO两个促进肺修复的技术方面进行研究：小鼠肺部炎症损伤时进行骨髓基质细胞移植，促进肺泡上皮修复性增殖；油酸诱导幼猪严重ARDS时，利用ECMO进行生命支持，以期调动机体自身修复能力，实现肺保护。第一部分小鼠骨髓基质细胞向肺泡上皮细胞分化的实验研究背景骨髓干细胞移植修复肺损伤是近年来的研究热点。已有研究证实，骨髓干细胞移植后定植于受损肺，能向肺泡上皮细胞、血管内皮细胞等分化，减轻炎症反应，修复肺部结构破坏，有望成为治疗ALI／ARDS的重要手段。骨髓基质细胞（BMSCs）易于分离培养，具有较强的自我更新和多向分化潜能，且取材方便，是肺损伤理想的细胞治疗种子细胞和基因治疗载体。本研究将BMSCs移植入致死剂量全身照射（TBI）小鼠体内，观察在合并内毒素（LPS）诱导肺部炎症损伤的情况下供体来源的BMSCs向肺泡上皮细胞分化的状况，为肺损伤修复探索新的方法。目的1．体外分离培养BMSCs并鉴定其生物学性状。2．建立LPS诱导肺部炎症损伤模型和BMSCs移植造血重建模型。3．观察BMSCs移植后能否向肺部迁移、分化成肺泡上皮细胞，及细胞移植效率，供体来源细胞是否参与了受损肺泡上皮的修复。方法1．利用全骨髓贴壁法培养BMSCs，行CD34、CD59和CD90.1免疫细胞荧光染色以分析其生物学特性，诱导其向成骨细胞、神经元分化以确定多向分化潜能。2．气道内滴入LPS诱导肺部炎症损伤模型，检测肺泡灌洗液中总蛋白（TP）、WBC计数和肺病理形态。3．致死剂量TBI后移植BMSCs，检测移植后外周血常规、骨髓有核细胞计数、肺、肝、脾病理形态变化，以确定有无造血重建。4．将绿色荧光蛋白（GFP）转基因小鼠BMSCs向TBI小鼠移植，7天、14天后进行GFP和肺泡上皮标记物CK5&8免疫荧光双标染色，并用流式细胞仪检测受体小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞（AECⅡ）GFP阳性率，和肺组织SP-A、SP-C、AQP5 mRNA表达。结果1．全骨髓贴壁分离培养BMSCs有良好的增殖能力，CD34表达阴性，经体外定向向成骨细胞分化，AKP表达增强，茜素红染色阳性；向神经元分化后MAP-2免疫细胞荧光染色阳性。2．气道内滴入LPS后第1天，肺泡灌洗液TP和WBC计数达高峰，伴显著的肺炎症损伤病理改变，以后TP和WBC逐渐下降，肺病理损害逐渐减轻。3．TBI后外周血和骨髓有核细胞在7天内降至最低点，未移植组小鼠在10天全部死于造血衰竭，移植BMSCs小鼠生存率为60-70％，外周血WBC、Pt、Hb和骨髓有核细胞计数逐渐回升。TBI后第3天有肺部轻度病理改变，合并LPS诱导肺炎症损伤时病变更重，但随后病变逐渐减轻，至第28天基本无病理改变。4．TBI和合并肺炎症损伤的TBI小鼠以GFP阳性BMSCs移植后第14天，免疫荧光双标染色检测到GFP和CK5&8双染阳性细胞，AECⅡGFP阳性率高于对照组，合并肺炎症损伤的TBI小鼠SP-C mRNA表达增加。结论用全骨髓贴壁法成功分离培养小鼠BMSCs，所培养细胞具有多向分化能力。建立LPS诱导小鼠肺炎症损伤模型和TBI后BMSCs移植造血重建模型，在移植后第14天，约10％AECⅡ来源于供体细胞，参与肺泡上皮的修复。当合并LPS诱导的肺部炎症损伤时，供体来源细胞向肺泡上皮细胞的分化有增加的趋势。第二部分体外膜肺救治油酸致急性呼吸窘迫综合征的实验研究背景ARDS是危及各个年龄层的危重疾病，我国小儿ARDS病死率高达62.9％，有必要探索新的治疗策略。ECMO作为一项新的生命支持技术，它的本质是一种改良的人工心肺机，对严重呼吸循环功能衰竭的患者提供较长时间的生命支持，当常规方法治疗ARDS均无改善时，ECMO可作为最终的救治手段。尽管在国外ECMO已临床应用三十余年，但我国尚处于起步阶段，应用ECMO治疗小儿呼吸衰竭尚无临床报道，动物实验的研究资料也很有限。本实验拟建立油酸诱导ARDS模型，探讨ECMO救治幼年动物ARDS的有效性和安全性，为临床应用提供实验基础。目的1．建立ECMO在健康和油酸诱导ARDS幼猪稳定转流模型。2．从呼吸力学、气体交换、血流动力学、重要脏器病理形态、脑氧合和灌注、炎症反应和内源性一氧化氮产生等方面，探讨ECMO的安全性和救治幼猪ARDS的有效性。方法21头5-6周龄、9-14kg幼猪经镇静麻醉后给予气管插管、常规机械通气，稳定30分钟后应用油酸经中心静脉诱导产生ARDS模型。分离右股动脉和左颈外静脉，分别置Picco动脉导管和漂浮导管，监测血流动力学；分离右颈外静脉和右股静脉，分别置静脉导管，作为ECMO转流的引血端和回血端。将动物随机分为4组：CON组（n=5），单纯机械通气24小时；ECMO组（n=6），以ECMO转流24小时后停转观察6小时；ARDS组（n=5），油酸诱导ARDS后单纯机械通气治疗；AEC组（n=5）：油酸诱导ARDS后以机械通气和ECMO治疗24小时，再停转观察6小时。在基础状态（Base）、成模时（0h）、以后每小时监测呼吸力学、气体交换、血流动力学指标，实验结束后留取肺泡灌洗液检测总蛋白（TP）、磷脂含量、磷脂表面张力，检测肺组织湿干重比（W／D）、髓过氧化物酶（MPO）、丙二醛（MDA）、炎症因子（TNFα，IL-1β，IL-6，IL-8）mRNA表达，取肺、肝、肠、肾、大脑海马送检病理形态，检测肺组织和心肌组织细胞凋亡，以近红外光谱仪（NIRS）监测脑氧合和脑灌注。为评价ECMO对内源性一氧化氮（NO）产生的影响，检测肺泡灌洗液和血清不同时点NO2-／NO3-含量，肺组织总一氧化氮合酶（tNOS）活性，诱生型和内皮型一氧化氮合酶（iNOS，eNOS）mRNA表达和肺组织内分布。结果1．ARDS模型的建立：油酸注射后4-6小时内可诱导出ARDS模型，成模时PaO2／FiO2＜200mmHg，动态顺应性（Cdyn）较基础状态下降50％以上。病理表现为弥漫性炎性细胞浸润、肺水肿及严重肺泡萎陷、出血等病理表现。2．生存率：至实验结束CON组和ECMO组全部存活，AEC组1只动物在转流22h死亡，ARDS组动物于成模后14-24h之间死亡。3．ECMO系统管理：ECMO转流期间血流量70-80ml／kg，全程维持活化凝血时间（ACT）180-220s，SvO268-75％之间。4．血流动力学：随着实验时间的延长，ECMO组心输出量（CO）有上升趋势，外周血管阻力（SVR）呈下降趋势；与ARDS组比较，AEC组平均动脉压（MABP）、CO、SVR均有一定的程度的改善。5．呼吸力学：各组Cdyn均下降，ECMO组16h、24h和Post点与Base比较差异有统计学意义（P＜0.01）。在0h点，ARDS组和AEC组Vd／Vt与Base比较显著增高（P＜0.05），以后ARDS组Vd／Vt进一步升高，而AEC组有下降趋势。AEC组PaCO2在0h点较Base显著升高（P＜0.01），但ECMO转流后PaCO2下降至正常范围，与同时点CON组比较差异无显著性意义。6．气体交换：ARDS组和AEC组成模后P／F显著下降，随后ARDS组P／F进一步下降，而AEC组在ECMO启动后P／F比值升高。CON组和ECMO组P／F随着实验时间延长，均有下降趋势。ARDS组和AEC组肺泡-动脉氧分压差（A-aDO2）、氧合指数（OI）、通气指数（Ⅵ）、肺内分流（Qs／Qt）变化趋势与P／F值相反，即随着ECMO启动，AEC组各指标均有一定程度的下降。ECMO组DO2在各时点均有高于其他组的趋势。7．血常规及血液生化：成模后ARDS组和AEC组WBC均有下降趋势。随着转流时间的延长，ECMO组和AEC组Hb和Hct均有下降趋势，但组内及组间比较差异均无统计学意义。生化指标各组内及组间均无显著差异。8．磷脂含量及表面张力：与CON组比较，ARDS组和AEC组总磷脂（TPL）下降，最小表面张力升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。ECMO组与CON组比较，TPL、DSPC／TPL和表面张力差异均无统计学意义。9．炎症损伤：与CON组比较，ARDS组和AEC组TP升高，DSPC／TP下降，W／D和MPO增高，IL-6和IL-8 mRNA表达增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。AEC组与ARDS组比较，各指标差异均无统计学意义。ECMO组与CON组比较，除DSPC／TP外，其余指标无均统计学意义。10．病理形态：与CON组比较，ECMO组肺、心、肝、肠、肾、大脑海马均有轻度病理损伤；与ARDS组比较，AEC组肺、肠病理损伤减轻，心、肝、肾、大脑海马病理变化相似。11．脑氧合和灌注：各组组内及组间比较，以NIRS监测脑氧合和脑灌注均无统计学差异。12．内源性NO：转流启动后，ECMO组和AEC组NO2-／NO3-含量下降，ECMO组肺组织eNOS mRNA表达低于其他三组，eNOS蛋白表达减少。结论成功复制油酸诱导幼猪ARDS模型，建立健康幼猪和ARDS幼猪ECMO稳定转流模型。ECMO转流24小时对健康和ARDS幼猪血流动力学状态、脑氧合和脑灌注无显著影响，能改善ARDS幼猪呼吸力学、氧合、气体交换、血流动力学状态，减轻肺、肠病理损伤，提高生存率，并未加重肝、肾、脑病理损伤。但ECMO激活健康幼猪全身炎症反应，引起肺、肝、肠、肾、脑轻度病理损伤。ECMO转流后肺组织eNOS表达下降，内源性NO产生减少。

论文目录

• 缩略语
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 小鼠骨髓基质细胞向肺泡上皮细胞分化的实验研究
• 第一节 小鼠骨髓基质细胞体外分离培养及分化潜能鉴定
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二节 小鼠骨髓基质细胞向肺泡上皮细胞分化
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 体外膜肺救治油酸致急性呼吸窘迫综合征的实验研究
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 结论
• 研究展望
• 综述
• 发表与待发表文章
• 致谢