两种植原体病害的分子检测与鉴定

论文摘要

本研究采用分子生物学方法,对引起桃树黄化和玉兰黄化的植原体进行了鉴定,主要结果如下：桃树是我国重要的果树作物,桃树黄化病表现为发病的叶片除叶脉仍然保持绿色外,叶片的其他部位均表现出均匀的黄化现象,在部分发病严重的枝梢上,出现叶片卷曲,皱缩的情况。病害危害1-2年后,病株整株出现黄化,部分枝梢落叶情况非常严重。桃树黄化病害发生的地点是一种点状的发生为主,病害有明显的扩散趋势。但是这种扩散趋势不是一种爆发式,而是通过一种年度积累扩散。本研究用分子生物学方法对我国北京地区利用针对植原体的通用引物,通过巢式PCR从自然表现黄化的桃树植株中扩增到了植原体16S rRNA。克隆、测序、进行序列分析并运用新的分类方法对其进行了分类,利用国际基因数据库GenBank中的BLAST程序对测序结果进行同源性检索发现,与其他16SrⅠ翠菊黄化组（Aster yellows group）组中的各植原体亲缘关系均在98%以上,充分肯定了其作为16SrⅠ组成员的分类地位。在荧光显微镜下,桃树黄化病枝韧皮部成熟筛管中产生健康植株中没有的特异性黄绿色荧光,嫁接实验证明植原体是桃树黄化的病原。由于在自然发病的桃树黄化病叶中植原体的含量很少,本研究对DNA提取方法和PCR的条件进行了一系列的摸索和改进,建立了优化的实验条件,包括在DNA提取过程中去掉叶肉、选用组培病苗等,进行PCR时对模板DNA稀释、选择最佳退火温度等。通过巢式PCR证明表现黄化症状的玉兰树中含有植原体。16SrRNA序列的结果表明与玉兰黄化相关的植原体属于翠菊黄化组16SrI亚组。本实验中的桃树黄化病、玉兰黄化病是国内外首次报道。本研究对桃树黄化植原体和玉兰黄化植原体进行了分子鉴定,初步研究了它与其它植原体的系统进化关系和分子差异；建立了桃树黄化植原体快速准确的检测、鉴定与鉴别的技术体系；为这些植原体的科学分类和命名、病原基因组学和功能基因组学研究、亚组及变异分析、病原检测、病害检疫及病害的治理等都奠定了良好基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 植原体研究进展
• 1 植原体概述
• 1.1 植原体的基本形态和结构
• 1.2 植原体基因组
• 1.3 植原体的生理特征和传播方式
• 1.4 植原体的分类
• 1.4.1 传统分类
• 1.4.2 血清学分类
• 1.4.3 DNA分子杂交分类
• 1.4.4 RFLP分类
• 1.4.5 基于核糖体RNA序列及系统发育的分类
• 1.5 植原体的分子检测和鉴定
• 1.5.1 血清学检测
• 1.5.2 核酸杂交检测
• 1.5.3 PCR检测
• 1.5.4 RFLP检测
• 1.5.5 异源双链迁移率分析
• 1.6 植原体的分子生物学
• 1.6.1 16S rRNA基因序列
• 1.6.2 16S rRNA-23S rRNA基因之间的间隔区域（SR）
• 1.6.3 核糖体蛋白质操纵子基因序列
• 1.6.4 延伸因子基因序列
• 1.6.5 植原体基因组及其染色质外DNA
• 1.7 翠菊黄化组的研究进展
• 2 植原体病害
• 2.1 植原体病害的症状
• 3 国内外研究现状
• 3.1 国内研究现状
• 3.2 国外研究现状
• 3.3 植原体病害的防治
• 4 本研究的立论依据、研究内容及意义
• 第二章 桃树黄化病病原的分子检测与鉴定
• 1 材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌株和载体
• 1.3 生化及分子生物学试剂
• 1.4 主要仪器设备
• 1.5 引物设计与合成
• 2 方法
• 2.1 植原体DNA的提取
• 2.2 植原体16S rDNA的Nest-PCR扩增
• 2.2.1 PCR反应体系
• 2.2.2 引物序列
• 2.2.3 PCR反应程序
• 2.2.4 琼脂糖电泳凝胶
• 2.3 植原体16S rDNA PCR产物的回收、克隆及测序
• 2.3.1 植原体16S rDNA PCR产物的回收
• 2.3.2 连接反应
• 2.3.3 连接产物转化大肠杆菌
• 2.3.4 转化大肠杆菌重组质粒DNA的提取和电泳
• 2.3.5 16S rRNA序列比较分析和进化树的组建
• 2.4 荧光显微镜观察实验
• 2.5 嫁接实验
• 3 结果与分析
• 3.1 田间症状表现
• 3.2 植原体DNA提取方法的改进和PCR条件的优化
• 3.3 PCR产物的克隆及重组质粒PCR鉴定结果
• 3.4 16S rDNA基因片段的序列分析
• 3.5 系统进化树的构建及分析
• 3.6 DAPI荧光染色检测
• 3.7 嫁接实验
• 4 讨论
• 第三章 玉兰黄化病病原的分子检测与鉴定
• 1 材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌株和载体
• 1.3 生化及分子生物学试剂
• 1.4 主要仪器设备
• 1.5 引物设计与合成
• 2 研究方法
• 2.1 样品DNA的提取
• 2.2 植原体的PCR反应
• 2.3 PCR产物的克隆与序列分析
• 3 结果与分析
• 3.1 田间症状表现
• 3.2 PCR检测
• 3.3 16SrDNA基因片段的序列分析
• 3.4 玉兰黄化病植原体系统进化树构建及分析
• 4 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介