论文摘要
背景和目的免疫炎症反应在脑缺血再灌注损伤中起重要作用。随着脑缺血损伤炎症机制研究的深入，炎性细胞因子的作用越来越受到关注。局部炎性因子、趋化因子及粘附分子的表达上调，构成了缺血性损伤向炎性损伤转变的基础，随后白细胞向缺血区的聚集和浸润导致了继发性神经元损伤和梗塞面积的扩大。核因子KB（NF-KB）是参与炎症反应的一个重要转录因子，是脑缺血病灶炎症反应过程中的关键环节。肿瘤坏死因子α（TNF-α）是一种重要的炎性细胞因子。在脑缺血再灌注的炎症反应中起级联放大作用。黏附分子在炎症发生、发展过程中起着重要作用。细胞间黏附分子（ICAM-1）是重要的黏附分子，介导血循环中的白细胞和脑微血管内皮细胞黏附、积聚、浸润于缺血区脑组织，促进了缺血后炎症的形成，产生缺血-炎症-缺血的恶性循环。垂体腺苷酸环化酶激活肽-38（pituitary adenylate cyclase-activatingpolypeptide，PACAP）是一种新的下丘脑促垂体激素，广泛分布于中枢神经系统，在正常情况下就能完整地透过血脑屏障，通过作用于PACAP受体而起作用，其神经营养、保护作用越来越受到人们的关注。Reglodi等动物实验发现，外源性的PACAP能缩小局灶性和全脑缺血后梗死面积，减轻缺血再灌注后神经元损伤。但其脑保护作用的分子机制尚不完全清楚。本实验采用线栓法制备大鼠缺血再灌注模型，观察PACAP对缺血再灌注损伤后NF-κB、TNF-α、ICAM-1表达的影响，目前国内外尚无这方面动物试验的报导，以探讨PACAP的脑保护机制，为PACAP治疗缺血性脑血管病提供实验依据。材料与方法1模型建立用Koizumi线栓法，建立大鼠局灶性脑缺血模型。将栓线从颈外动脉至颈内动脉，插入左侧大脑中动脉（MCA），遇阻即止，线栓前端颈内动脉起始处约18.5±1.0mm，阻断该侧MCA的血流供应。假手术组线栓深度为10mm。线栓插入后出现左侧Horner征，Longa评分为1～3分认为模型制作成功。模型成功的大鼠在缺血2h后拔线至颈外动脉残端内进行12h、24h再灌注。2实验动物分组及给药方法健康SD大鼠72只，体重300±20 g，随机分为假手术组、缺血再灌注组和PACAP组，PACAP组于再灌注30分钟内，由尾静脉注射，1×10-9mol／kg。假手术组和脑缺血再灌注组，用等体积生理盐水代替PACAP。按分组规定的再灌注时间断头取脑，36只标本迅速放入液氮保存，用作Western印迹检测；其余标本准备制作石蜡切片。3指标观测（1）神经功能缺损评分：参考Longa 5分制评分标准，分别于缺血2h再灌注12h、24h进行神经功能评分。（2）HE染色：光学显微镜下观察脑组织病理变化。（3）免疫组织化学染色：活化的NF-κB阳性染色为胞核棕色颗粒、TNF-α和ICAM-1阳性细胞胞浆被染成棕黄色。在显微镜下放大400倍，随机选择不重叠的6个视野，统计阳性细胞数。ICAM-1切片在显微镜下放大400倍，随机选择不重叠的6个视野，统计阳性血管数，测得的数据用（?）±s表示。Western-blot：检测NF-κB的表达，并通过凝胶成像系统定量扫描灰度值。4统计方法实验数据用均数±标准差（（?）±s）表示。应用SPSS11.5统计软件进行数据分析，符合正态分布、方差齐的两组均数间比较采用t检验，神经功能缺损评分采用q检验，以α=0.05作为检验水准。结果1神经功能缺损评分：假手术组神经功能缺损评分为0分，缺血再灌注组12h、24h评分分别为2.00±0.06、2.36±0.78，与假手术组数值比较，有显著性差异（P＜0.05）。PACAP组大鼠缺血再灌注后12h、24h组评分分别为1.08±0.56、1.09±0.62，与缺血再灌注组相比，有显著性差异（P＜0.01）。2脑组织病理变化：假手术组大鼠大脑外观正常，无肿胀，表面血管清晰可见；缺血再灌注组大鼠缺血侧大脑半球与对侧相比肿胀明显，MCA供血区苍白，无光泽，表面血管消失。脑组织切片显示：假手术组脑组织结构无明显异常；缺血再灌注组可见大量变性及坏死的神经细胞，少量胶质细胞，灶周有胶质细胞、炎性细胞；且随再灌注时间的延长而加重；PACAP组皮层缺血中心范围较小，病变较缺血再灌注组明显减轻。3 NF-κB的表达：假手术组NF-ΚB细胞核内微量表达；缺血再灌注组的缺血侧大脑半球在再灌注后12、24hNF-ΚB细胞核内表达增高。PACAP组脑缺血再灌注后NF-ΚB细胞核内表达明显减少。Western印迹检测NF-ΚB表达结果：再灌注后12h、24h脑缺血再灌注组分别为98.06±13.70，74.46±10.30，与假手术组数值比较，有显著性差异（P＜0.01）；PACAP组分别为56.62±6.86，48.56±8.12，与缺血再灌注组比较，有显著性差异（P＜0.01）。4 TNF-α的表达：假手术组阳性细胞数分别为2.83±0.75、2.96±0.68。缺血再灌注组再灌注12h和24h分别为40.82±3.71、60.67±3.49，与假手术组比较，有显著性差异（P＜0.01）。PACAP组分别为20.70±1.33、30.00±2.48，与缺血再灌注组比较，有显著性差异（P＜0.01）。5 ICAM-1的表达：假手术组ICAM-1阳性血管数分别为0.56±0.16、0.64±0.02。缺血再灌注组再灌注12h和24h分别为6.00±0.66、12.02±1.51，与假手术组比较有显著性差异（P＜0.01）；PACAP组分别为1.68±0.42、4.02±0.50，与缺血再灌注组比较，各时间点的表达量均显著减少，有显著性差异（P＜0.01）。结论1．本实验采用大脑中动脉线栓法成功制备局造性缺血再灌注模型，接近人类缺血性脑血管病的发生过程，能准确控制脑缺血及再灌注时间，创伤小、重复性好、再灌注成功率高、梗死灶恒定。2．应用PACAP后可以降低大鼠缺血再灌注损伤后的神经功能缺损评分，减轻脑组织病理改变。3．应用PACAP可以减少缺血再灌注损伤后NF-ΚB、TNF-α、ICAM-1的表达。4．本实验为PACAP治疗脑缺血再灌注损伤提供了实验依据，PACAP有望成为一种新的脑保护剂，在缺血性脑血管病的治疗中发挥作用。
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