硼替佐米对骨髓瘤患者破骨细胞的作用及机制研究

论文摘要

多发性骨髓瘤的突出临床特点之一是骨质破坏,这种进行性的骨质破坏在临床上表现为骨痛、高钙血症、病理性骨折、弥漫性骨质疏松等,从而严重影响患者的生活质量和预后。约有85%以上的多发性骨髓瘤患者会出现骨质破坏,这也是患者最常见的死亡原因。骨髓瘤骨质破坏的主要原因是破骨细胞大量生成和激活。已有资料表明,在患者骨破坏区成骨细胞活性下降,而破骨细胞数量明显增多且功能活跃,导致新骨形成减少或消失,骨的再吸收增加而发生溶骨病变。正常情况下,骨质内环境的稳定主要通过RANK/RANKL/OPG系统来实现。破骨细胞和破骨前体细胞表面表达核因子κB受体激活剂（RANK）,RANK与可溶性的或成骨细胞/基质细胞表面的RANKL结合,通过胞内信号传导途径,促进破骨细胞的分化成熟和骨吸收功能。骨保护素（OPG）以一种诱饵受体的形式,与RANKL结合,竞争性地阻断了RANKL和RANK之间的联系,起到平衡骨质内环境的作用。在骨髓瘤患者体内,骨髓瘤细胞本身表达RANKL增加,或通过与周围基质细胞的相互作用,促进基质细胞的RANKL的表达,同时削弱骨质微环境中OPG的作用;另外IL-1β、PTHγ、MIP-1α等细胞因子直接或间接刺激破骨细胞,增加破骨细胞的活性,引起溶骨性病变。破骨细胞表面的RANK通过下游连接蛋白来激活信号转导通路,研究表明肿瘤坏死因子受体相关蛋白6（TRAF6）与RANK结合的位点比较独特,TRAF6基因敲除的小鼠表现为破骨细胞分化障碍和破骨细胞活性丧失,说明TRAF6是RANK信号转导通路中必需的上游效应器。RANKL的信号经RANK传递给TRAF6,再经TRAF6激活下游NF-κB通路、MAPK通路、PI3K/Akt通路和CN/NFAT等通路,引起破骨细胞的一系列生物学反应。除RANK/RANKL/OPG系统外,破骨细胞受到内环境中很多因子和刺激因素的影响。近来一项值得注意的研究表明,将蛋白酶体抑制剂MG-132和MG-262直接作用于外周血单个核细胞来源的破骨样细胞,可以观察到破骨细胞分化受抑,骨吸收功能明显下降,并以剂量依赖的方式减弱耐酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）活性,也减弱了TRAF6下游信号传导因子NF-κB的活性。并由此可以推断,某些蛋白酶体抑制剂不仅可用于治恶性疾病本身,而且可在一定程度上直接改善肿瘤相关性骨病的预后。近年来,在多发性骨髓瘤的治疗方面涌现出一批新的靶向药物,其中蛋白酶体抑制剂硼替佐米（Bortezomib,商品名Velcade）具有全新的和独特的作用机制,被美国FDA批准用于复治性和难治性骨髓瘤的治疗。在真核生物体内,细胞内蛋白的降解主要通过泛素-蛋白酶体通路。而硼替佐米通过抑制蛋白酶体20S亚单位的活性,从而稳定NF-κB的抑制剂κB,阻止NF-κB的核易位,抑制NF-κB的活性,导致细胞抗凋亡蛋白水平降低,诱导细胞凋亡;同时通过选择性抑制一些特异的蛋白降解,包括细胞周期依赖的激酶抑制剂和抑癌蛋白（如cyclin E、p21wafl/Cip1、p27、p53）导致细胞凋亡。由于硼替佐米的作用,必然使得骨髓瘤细胞介导的细胞因子表达发生改变,从而间接影响到破骨细胞的分化成熟和功能。然而,联系到上述醛酞类蛋白媒体抑制剂对于破骨细胞的作用,我们感兴趣的是:硼替佐米是否能直接影响到破骨细胞的分化与功能,如果能,其中可能的机制又是如何?因此,本课题拟使用蛋白酶体抑制剂硼替佐米直接作用于骨髓瘤骨病患者的破骨细胞,观察该药物对于破骨细胞的直接作用,并且进一步观察药物对TRAF6水平及其泛素化后降解的影响,从而发现在多发性骨髓瘤治疗中万珂在骨病方面可能的新的作用,并且初步探讨蛋白酶体抑制剂在破骨细胞中的作用靶点和作用机制。研究包括以下三个部分:第一部分从外周血诱导培养获得破骨细胞的研究从正常人外周血单个核细胞诱导培养着手,建立获得高产量高纯度破骨细胞的方法,为骨肿瘤患者破骨细胞的体外研究提供丰富的细胞来源。从人外周血分离单个核细胞贴壁培养,采用0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA联合消化,纯化后以RANKL和M-CSF加以诱导。结果显示,与传统方法相比,该方法可于每96孔板中获得1426±204个破骨细胞（P＜0.05）,0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA联合消化可使破骨细胞纯化率达90%。诱导生成的破骨细胞TRAP染色阳性,功能试验显示具有噬骨能力。结论:该培养方法可产生大量的破骨样细胞,方法简便而且经济实用,可为破骨细胞的蛋白质学研究及分子生物学研究提供丰富的细胞来源。第二部分硼替佐米对多发性骨髓瘤患者破骨细胞分化和功能的影响观察在多发性骨髓瘤患者破骨细胞体外诱导分化成熟过程中,硼替佐米对其分化和功能的影响。在患者外周血单个核细胞经核因子κB受体活化因子配体（RANKL）及巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）诱导向破骨细胞分化过程中,采用0.5nM、1nM、2.5nM、5nM硼替佐米进行处理,14天观察TRAP（+）破骨细胞数量,检测各孔培养液中的耐酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）活性,28天后观察骨片上骨陷窝的数量。结果显示,100倍光镜下2.5nM、5nM硼替佐米组破骨细胞数量为157±21和98±15个,较对照组（307±25）明显减少（P＜0.05）,骨陷窝形成数量分别为对照组的53±24%和29±7%（P均＜0.05）,上清液中破骨细胞活性分别为对照组的86±24%和60±25%（P均＜0.05）。结论:硼替佐米可抑制骨髓瘤患者破骨细胞的分化和功能,可能成为骨髓瘤骨病治疗的新方法。第三部分硼替佐米通过抑制TRAF6影响多发性骨髓瘤患者破骨细胞的生成研究在硼替佐米作用下,破骨细胞分化过程中上游的关键信号分子TRAF6的改变。在患者外周血单个核细胞经RANKL及M-CSF诱导向破骨细胞分化过程中,用小剂量硼替佐米进行处理破骨前体细胞,采用western-blot、RT-PCR、IP法,分析硼替佐米对破骨前体细胞中TRAF-6蛋白、mRNA及TRAF-6泛素化水平的影响。结果显示,破骨前体细胞经硼替佐米处理后观察24小时,TRAF6蛋白活性逐渐降低,TRAF6的mRNA水平也有所下降,实验中硼替佐米未能抑制TRAF-6的泛素化和降解过程。结论:硼替佐米抑制骨髓瘤患者破骨细胞的分化和功能的作用可能与上游信号分子TRAF6减少有关。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩写中英文对照表
• 前言
• 第一部分 从外周血诱导培养获得破骨细胞的研究
• 一、材料和方法
• 二、实验结果
• 三、讨论
• 参考文献
• 第二部分 硼替佐米对骨髓瘤患者破骨细胞分化和功能的影响
• 一、材料和方法
• 二、结果
• 三、讨论
• 参考文献
• 第三部分 硼替佐米通过抑制TRAF6影响多发性骨髓瘤患者破骨细胞的生成
• 一、材料和方法
• 二、结果
• 三、讨论
• 参考文献
• 小结
• 综述一 破骨细胞分化中的信号分子及与多发性骨髓瘤的关系
• 综述二 骨髓瘤骨病的发生机制
• 发表、完成论文及主要成绩
• 致谢