东方田鼠KPNA2基因克隆及抗日本血吸虫实验研究

论文摘要

东方田鼠是迄今发现对日本血吸虫抗性最强的啮齿类哺乳动物。从东方田鼠体内分离其抗日本血吸虫的抗性物质,有助于人类从分子水平上揭示东方田鼠天然抗日本血吸虫的机理也有助于血吸虫病防治新型手段的研发。在前期研究中,我们从东方田鼠骨髓cDNA文库中分离获得了一个具有显著体外杀伤日本血吸虫童虫的次级亚基因池gE76。因此,我们拟从次级亚基因池gE76中继续分离单个活性的基因,并探讨其生物学功能。一、东方田鼠抗日本血吸虫抗性相关基因gE76.44的筛选实验利用表达克隆法对有较高体外杀伤日本血吸虫童虫活性的东方田鼠骨髓次级亚基因池gE76进行了筛选。将其转化大肠杆菌DH5a并铺板,随机挑取246个单克隆,分别进行质粒DNA抽提,EcoRⅠ酶切,1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,共获取153个有插入片段质粒,选择插入片段≥800 bp的不同重组质粒37个,转化大肠杆菌DH5α并提取质粒DNA,转染HEK293 T细胞,制备条件培养基后,进行体外杀伤日本血吸虫童虫实验,在96 h内连续观察童虫死亡情况,统计死亡率,共获得四个杀虫效果较为显著的克隆：44号、69号、85号及109号,其童虫死亡率分别为16.7%、16.5%、10.4%、11.3%,与对照组比较具有统计学意义。经测序后其EST序列长度分别为2008bp、1626bp、1420bp、828bp。序列同源性比较发现：44号为核转运受体蛋白质karyopherin （importin） alpha 2,其序列中包含全长ORF,根据测序及多次重复杀虫实验结果,我们把44号基因作为从东方田鼠骨髓基因表达文库中筛选到的新的候选抗日本血吸虫相关基因,暂时命名为Mf-gE76.44进行下游实验。二、gE76.44基因生物信息学分析及其功能分析运用生物信息学方法对东方田鼠抗性相关基因gE76.44全长核苷酸序列进行结构和功能分析,BLASTN同源性比对发现：gE76.44与小鼠karyopherin alpha 2 （KPNA2） （NM-010655）的序列相似性为89.8%；多序列比对分析发现：小鼠、牛、人、大鼠和东方田鼠KPNA2的核苷酸及氨基酸序列存在差异；3D-JIGSAW （version 2.0）软件分析结果也证明东方田鼠和小鼠KPNA2蛋白分子立体结构上也存在明显差异。实验将小鼠KPNA2 （Ms-KPNA2）基因重组到真核表达载体pcDNA1.1,分别制备东方田鼠（Mf-KPNA2）及小鼠（Ms-KPNA2） KPNA2条件培养基,检测两者真核表达产物体外杀伤日本血吸虫童虫效果。扣除空白对照组童虫死亡率,Mf-KPNA2和Ms-KPNA2的条件培养基杀虫率分别为15.8%,2.8%,两者相比差异显著（P=0.003）。实验还从mRNA水平比较分析了KPNA2在正常东方田鼠和小鼠体内不同组织中的表达情况以及感染日本血吸虫0d,7d,12d后KPNA2基因在肝脏和肺脏组织中的表达。结果表明：不同组织间KPNA2的表达存在显著差异,东方田鼠在感染日本血吸虫后12d,肝脏KPNA2基因表达较小鼠显著上调。三、Mf-KPNA2基因治疗效果及表达情况分析为进一步确认Mf-KPNA2的抗日本血吸虫活性,我们建立了感染血吸虫小鼠模型,应用逆转录病毒载体pLXSN,建立pLXSN-KPNA2重组逆转录病毒载体系统,通过小鼠尾静脉注射,将重组病毒导入小鼠体内,检测重组病毒治疗后感染小鼠的减虫率、肝脏减卵率、血吸虫虫体改变及小鼠肝脏肉芽肿减少情况。pLXSN-KPNA2重组病毒经PA317细胞包装、浓缩、病毒滴度测定后,同空载体pLXSN病毒组,DMEM对照组一道,分三次尾静脉注射日本血吸虫感染小鼠。实验结果显示：pLXSN-KPNA2重组病毒治疗组较DMEM处理组,空载体pLXSN病毒对照组小鼠减虫率分别为：39.42%（P=0.006）和38.97%（P=0.007）；肝脏减卵率分别为76.50%（P=0.000）和75.04%（P=0.000）差异显著,有统计学意义。不同处理组感染小鼠体内KPNA2基因在不同组织间的表达也存在明显差异,小鼠感染血吸虫后7d, pLXSN-KPNA2病毒处理组小鼠体内KPNA2基因在肝脏,肾脏和肌肉组织中高表达。四、东方田鼠胚胎成纤维永生化细胞系的建立Mf-KPNA2基因具有显著体外、体内杀伤日本血吸虫的作用,为了深入研究其抗虫机制,我们对东方田鼠胚胎成纤维细胞进行了体外分离和培养,并采用脂质体介导的基因转染法,将质粒pSV3 neo（含有SV40 T抗原基因和neo抗性基因）转染第三代东方田鼠胚胎成纤维细胞,首次建立了东方田鼠胚胎成纤维永生化细胞系,为进一步从细胞水平深入研究其抗虫机理及开展不同动物成纤维细胞间比较研究奠定基础和提供细胞实验材料。综上所述,本研究应用表达克隆法从东方田鼠骨髓基因表达文库筛选到一个日本血吸虫抗性相关基因Mf-KPNA2。东方田鼠与小鼠KPNA2在氨基酸结构域序列和数量上存在显著差异；东方田鼠体内不同组织间KPNA2表达丰度存在差异,而且与小鼠体内相同组织中的表达情况也完全不同。体外、体内实验结果均显示：该基因有着显著的抗日本血吸虫活性。同时,我们还建立了东方田鼠胚胎成纤维永生化细胞系,以上结果为进一步研究其抗日本血吸虫机制奠定了良好的基础。

论文目录

• 摘要
• 英文摘要
• 英文缩写词简表
• 前言
• 第一章 东方田鼠抗日本血吸虫抗性相关基因gE76.44的筛选
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 第二章 gE76.44基因生物信息学分析及其功能分析
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 第三章 Mf-KPNA2基因治疗效果及表达情况分析
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 第四章 东方田鼠胚胎成纤维永生化细胞系的建立
• 4.1 材料
• 4.2 方法
• 4.3 结果
• 4.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述一
• 参考文献
• 综述二
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士期间的主要研究成果