鲍鱼内脏β-1,3-葡聚糖酶的分离纯化及性质研究

论文摘要

β-1,3-葡聚糖酶（EC 3.2.1.39）是一类能够特异性水解p-1,3糖苷键的水解酶,广泛存在于微生物、植物和动物中。β-1,3-葡聚糖酶主要分布于海洋无脊椎动物中,该酶在生物体内的碳水化合物代谢过程中起着十分重要的作用,是海洋无脊椎动物重要的消化酶之一。本文以新鲜鲍鱼内脏为材料,经过匀浆、硫酸铵盐析沉淀、DEAE-52离子交换柱层析、Sephacryl S-200 HR凝胶过滤等步骤,分离纯化出电泳纯的β-1,3-葡聚糖酶,并研究了部分酶学性质。分别采用苯甲基磺酰氟（PMSF）,N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）、二巯基苏糖醇（DTT）、琥珀酸酐（SUAN）、氯胺-T等化学修饰剂修饰鲍鱼内脏p-1,3-葡聚糖酶。最后应用薄层层析（TLC）分析了酶的水解产物。实验结果表明,新鲜鲍鱼内脏经0.1 mol/L pH6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液匀浆破碎,浸提12h后,60%硫酸铵饱和度盐析,再经DEAE-52离子层析、Sephacryl S-200HR凝胶层析获得纯化的p-1,3-葡聚糖酶。纯化的鲍鱼内脏p-1,3-葡聚糖酶经Native-PAGE和SDS-PAGE鉴定皆得到一个条带,分子量约为28.5 kDa,酶的纯化倍数为最初的5.11,比活力为21.02 U/g。测得该酶的最适pH为5.0,pH在3.0～6.0之间该酶有较好的稳定性,温度在0℃-40℃时有很高的稳定性。Fe3’对该酶活性基本无影响,Ni’、Cu2’、Mg2’、Hg’对该酶活性有抑制作用。米氏常数Km为0.4034 mmol/L。纯化的鲍鱼内脏p-1,3-葡聚糖酶对昆布多糖有强的水解作用,酶活力为2.84 U。巯基抑制剂E-64对酶活力具有一定激活作用,野尻霉素对鲍鱼内脏p-1,3-葡聚糖酶有显著抑制作用,糖酶抑制剂D-葡萄糖醛酸-内脂、金属蛋白酶抑制剂EDTA对酶活影响不明显。N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）和氯胺-T的修饰能显著抑制酶的活力,苯甲基磺酰氟（PMSF）、琥珀酸酐（SUAN）、二巯基苏糖醇（DTT）等对酶活力的影响与修饰剂的浓度有关。因此,推断色氨酸和甲硫氨酸可能是鲍鱼内脏p-1,3-葡聚糖酶必需功能基团。薄层层析（TLC）显示,鲍鱼内脏p-1,3-葡聚糖酶可充分水解昆布多糖得到二糖。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 鲍鱼
• 1.2 消化酶
• 1.2.1 水产动物消化酶的研究现状
• 1.2.2 鲍鱼消化酶的研究进展
• 1.3 β-葡聚糖酶
• 1.3.1 β-葡聚糖酶的来源
• 1.3.2 β-葡聚糖酶的分类及功能
• 1.3.3 β-葡聚糖酶的应用
• 1.4 β-1,3-葡聚糖酶
• 1.4.1 β-1,3-葡聚糖酶的研究进展
• 1.4.2 β-1,3-葡聚糖酶的应用
• 1.5 本课题主要研究内容及意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 主要实验仪器
• 2.1.3 主要实验试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 考马斯亮蓝G-250染色法测蛋白质含量
• 2.2.2 β-1,3-葡聚糖酶活力的测定
• 2.2.3 硫酸铵盐析沉淀蛋白
• 2.2.4 酶液的透析和浓缩
• 2.2.4.1 透析法除硫酸铵
• 2.2.4.2 超滤法浓缩酶液
• 2.2.5 β-1,3-葡聚糖酶的分离纯化
• 2.2.6 电泳方法
• 2.2.7 β-1,3-葡聚糖酶酶学性质的测定
• 2.2.8 β-1,3-葡聚糖酶底物特异性的测定
• 2.2.9 β-1,3-葡聚糖酶反应动力学的研究
• 2.2.10 β-1,3-葡聚糖酶的化学修饰
• 2.2.11 β-1,3-葡聚糖酶水解尾布多糖产物的分析
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 硫酸铵盐析
• 3.2 β-1,3-葡聚糖酶的分离纯化
• 3.2.1 DEAE-52阴离子交换层析
• 3.2.2 Sephacryl S-200 HR凝胶层析
• 3.2.3 纯化结果分析
• 3.2.3.1 纯化结果
• 3.2.3.2 Native-PAGE对纯度的测定
• 3.2.3.3 SDS-PAGE对分子量的测定
• 3.3 酶学性质的研究
• 3.3.1 酶的最适pH
• 3.3.2 酶的pH稳定性
• 3.3.3 酶的温度稳定性
• 3.3.4 金属离子对酶活力的影响
• 3.3.5 抑制剂对酶活力的影响
• 3.4 底物特异性的研究
• 3.5 β-1,3-葡聚糖酶反应动力学参数的测定
• 3.6 功能基团的化学修饰
• 3.6.1 苯甲基磺酰氟（PMSF）对β-1,3-葡聚糖酶活力的影晌
• 3.6.2 二硫苏糖醇（DTT）对β-1,3-葡聚糖酶活力的影晌
• 3.6.3 琥珀酸酐（SUAN）对β-1,3-葡聚糖酶活力的影晌
• 3.6.4 N一溴代琥珀酰亚胺（NBS）对β-1,3-葡聚糖酶活力的影晌
• 3.6.5 氯胺-T（Cl-T）对β-1,3-葡聚糖酶活力的影晌
• 3.7 酶解产物的定性分析
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录A