microRNA-346通过靶定hTERT的表达影响宫颈癌细胞增殖

论文摘要

[研究目的]微小RNA（microRNA,miRNA）是一类非编码调控单链小分子RNA,能够通过与靶mRNA特异性的碱基配对结合对靶基因进行转录后水平调控。近年来的研究表明,某些miRNA具有抑癌基因或癌基因活性,这些miRNA通过调控其靶基因的表达水平,在肿瘤发生和发展过程中发挥极其重要的作用。本文旨在阐明miR-346在宫颈癌组织及癌旁正常组织中的差异性表达及其对宫颈癌细胞生长的影响,并研究其上调hTERT的表达发挥着癌基因的作用机制。[方法]首先我们应用Real-time PCR技术检测miR-346在人宫颈癌癌组织和癌旁正常组织中的差异表达,发现miR-346在癌组织中表达上调。接着利用生物信息学方法筛选出miR-346肿瘤相关的候选靶基因,并利用荧光报告载体实验验证miR-346对其靶基因hTERT的直接调控作用。然后通过Real-time PCR和Western blot技术检测miR-346对宫颈癌细胞和内源性hTERT mRNA水平和蛋白水平的表达变化,进一步验证miR-346对hTERT的调控作用。接着,在两种人宫颈癌细胞系HeLa、C33A细胞中,分别过表达和封闭miR-346,利用MTT实验和细胞集落形成实验以及细胞生长曲线实验检测细胞生长活性的变化。之后利用免疫功能缺陷型裸鼠移植瘤实验封闭内源性miR-346检测活体内肿瘤生长变化。最后应用挽救实验验证了 miR-346对hTERT调控的特异性。[结果]Real-time PCR结果显示,miR-346在人宫颈癌癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织。在两种宫颈癌细胞系中,过表达miR-346增强其功能后,细胞增殖均明显增强,并且集落形成能力均明显增强。而封闭miR-346则导致宫颈癌细胞生长停滞,体外成瘤能力明显减弱。靶基因验证实验显示hTERT（端粒酶催化亚单位）作为一种癌基因,是miR-346候选靶基因,其3’非翻译区包含miR-346的潜在结合位点。荧光报告载体实验表明,miR-346能够通过作用于hTERT基因的3’非翻译区（3’untranslated region,3’UTR）的特定位点,对其表达进行正性调节。而在miR-346过表达的宫颈癌细胞系HeLa细胞中,hTERT基因的mRNA表达水平和蛋白表达水平都有明显上调,在宫颈癌组织中hTERT基因的mRNA表达水平明显高于癌旁正常组织。将hTERT基因沉默以后,细胞增殖均明显受到抑制,MTT细胞活性、细胞集落形成能力均明显降低。转染了不含3,UTR的hTERT后也能有效的挽救由封闭miR-346的表达引起的细胞活性、细胞集落形成能力降低。[结论]miR-346能够增强宫颈癌细胞的增殖,起到癌基因的作用。在宫颈癌细胞中,高表达的miR-346对癌基因hTERT表达水平的上调能力增加,使hTERT的促增殖活性增强,造成宫颈癌细胞生长速度加快,封闭miR-346以后得到相反的细胞表型结果。同时,我们的实验对传统的miRNA的调节作用做出了一个挑战因为传统的调节机制无外乎就是通过与靶基因的3’ UTR区结合来对靶基因进行翻译抑制,而我们研究出来的结果却是通过该区对靶基因进行翻译上调,或许是通过与该区域结合,抑制了其他的miRNA对其的降解,通过增强其稳定性促进了翻译,他的功能可能更加多元化和不为人知。通过阐明miR-346在宫颈癌中的具体作用机制及其靶基因的研究有利于我们对宫颈癌的发生发展进行深入的理解,同时也为临床上宫颈癌的诊断和治疗提供新的实验数据。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、miR-346在宫颈癌中的作用研究
• 1.1 材料和方法
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 实验方法
• 1.2 结果
• 1.2.1 Real-time PCR检测miR-346在子宫颈癌组织和正常子宫颈组织中的差异表达
• 1.2.2 pcDNA3.1/pri-miR-346质粒的构建
• 1.2.3 细胞转染效率检测
• 1.2.4 Real-time PCR检测pcDNA3.1/pri-miR-346表达的有效性
• 1.2.5 MTT实验检测miR-346对宫颈癌细胞生长活性的影响
• 1.2.6 细胞集落形成实验检测miR-346对宫颈癌细胞集落形成能力的影响
• 1.2.7 细胞生长曲线实验检测miR-346对宫颈癌细胞生长能力的影响
• 1.2.8 动物实验检测封闭内源性miR-346对裸鼠成瘤能力的影响
• 1.3 讨论
• 1.3.1 miR-346的研究进展
• 1.3.2 miR-346对宫颈癌细胞的表型影响
• 1.4 小结
• 二、miR-346在宫颈癌细胞系中靶定hTERT的确定及验证
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 EGFP荧光报告载体的构建
• 2.2.2 EGFP荧光报告载体实验验证hTERT是miR-346的直接作用靶基因
• 2.2.3 Real-Time PCR方法检测在过表达以及封闭miR-346后的HeLa细胞中hTERT mRNA的表达水平
• 2.2.4 免疫荧光实验检测在过表达及封闭miR-346后的HeLa细胞中hTERT蛋白的表达水平
• 2.2.5 Western blot检测在封闭miR-346后的HeLa细胞中hTERT蛋白的表达水平
• 2.3 讨论
• 2.3.1 荧光报告载体实验、Real-time PCR实验在靶基因验证中的作用
• 2.3.2 miR-346对靶基因hTERT的正性调节作用
• 2.4 小结
• 三、挽救实验验证miR-346对hTERT靶定作用的特异性
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 RT-PCR和Western blot验证pSilencer/si-hTERT质粒的有效性
• 3.2.2 MTT实验分析hTERT对宫颈癌细胞生长活性的影响
• 3.2.3 细胞集落形成实验分析hTERT对宫颈癌细胞集落形成能力的影响
• 3.2.4 挽救实验验证miR-346对hTERT靶定功能的特异性
• 3.3 讨论
• 3.3.1 基因hTERT的介绍
• 3.3.2 基因hTERT与肿瘤的关系
• 3.3.3 基因hTERT对宫颈癌细胞生长的影响
• 3.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述 MicroRNA、hTERT与宫颈癌
• 综述参考文献