烟草（N.tabacum L.）高香气特征性状的鉴定及其分子标记研究

论文摘要

烟草（N.tabacum L.）作为一种吸食性叶用经济作物,烟叶香气和吃味是衡量其吸食品质和可用性的重要因素,目前世界烟草生产先进国家所产烟叶虽然大都具有较好的香吃味,但仍然把提高烟叶香吃味尤其香气作为推动烟叶生产发展的主攻方向。有关研究表明,在影响烟叶香吃味的诸多因素中,品种是提高烟叶香吃味的重要因素。本研究的目的在于:1)为烟草高香气特征性状的鉴定提供生化物质成分和分子生物学依据;2)为以提高烟叶香气为主攻方向的烟草品质育种,提供香气性状的选择、鉴定方法;3)为高香气目的基因的定位、克隆、转化利用等奠定理论与实验基础。研究内容以特香型烤烟、香料烟、名优晒晾烟等高香气基因型和生产上主要推广种植的普通香型烤烟品种为供试材料,通过高香气特征性状的鉴定、生化证据研究和遗传群体的构建,在生物化学和分子生物学分子水平上对其高香气特征性状进行了遗传定位研究。主要研究结果如下。1、以香气性状存在明显差异的烤烟特香型品种大白筋599和普通香型品种K326为亲本,构建了F2、BC1和DH遗传群体,对其高香气特征性状应用SSR和TRAP标记初次进行了遗传定位研究,并采用烟叶感官评吸鉴定方法进行了比对验证和遗传变异分析,同时对分子标记在遗传群体上的偏分离情况进行了统计检验。结果表明,烟草高香气特征性状属于孟德尔显性质量遗传,筛选到一个距离该性状8.37cM的SSR标记。2、对普通烤烟、特香型烤烟、香料烟和名优晒晾烟品种调制后的原烟,应用气相色谱技术比较分析了烟草主要栽培类型间烟叶的致香物质成分。在检测到的52种香味成分中,6种致香成分与烟草品质类型的划分密切相关。根据致香成分对供试材料进行聚类分析结果表明,特香型烤烟、香料烟和晒晾烟为一类,普通烤烟单独成类。烟叶经感官评吸鉴定,供试的特香型烤烟、香料烟和晾晒烟品种中均存在一种普通香型烤烟不存在的类似香料烟的特征性香气,其与致香成分聚类分析结果一致。对聚类和评吸鉴定出的两类烟草品种的致香成分经统计分析,有26种致香成分在普通烤烟品种与其它类型烟草品种间存在显著或极显著差异,除棕榈酸和2-甲基四氢呋喃-3-酮外,其余24种致香成分在普通烤烟类型中含量均较其它烟草品种低。这为烟草类型的划分和特殊香味物质成分的鉴定奠定了生物学与应用化学基础。3、对Bassam和Sanguinetti两种银染方法,在标记检测效率、成本及染色效果等方面进行了比对研究,并对其在SRAP标记和TRAP标记中的应用进行了探讨。结果表明,Sanguinetti银染法比Bassam银染更为简便、经济,在染色照片的色阶图中Sanguinetti染色方法的背景与扩增带区分明显,能够清楚地读带,说明该方法能够扩增出很好的SRAP和TRAP标记谱带。建议在SRAP和TRAP标记检测中采用Sanguinetti银染方法。4、研究开发出了一种直接利用EST-SSR引物作为固定引物开发TRAP标记的新方法,并在具有类香料烟特征性香气的烤烟、香料烟和晒晾烟品种中筛选到一个特征性遗传标记,该标记在具有类香料烟特征性香气的普通烟草品种中能够扩增出一条大约400bp的特征带,呈共显性遗传,可以直接或转化成SCAR标记后用于分子标记辅助选择育种,也可以进一步测序发掘新基因。5、发明了一种开发ILP标记的新方法。该方法首先在EST序列上随机搜索引物,然后在基因组序列内做电子PCR,最后通过扩增产物长度的变化来筛选ILP标记。根据该方法,采用C#语言编写了一个开发ILP标记的计算机软件,并成功的在烟草上筛到了6,859对可能的ILP标记,初步合成了207对进行实验;同时对茄科共有序列标记（ACGM）的开发进行了探索,合成了5对烟草-番茄ACGM,实际扩增检测表明,上述标记扩增效果良好,在烟草和番茄间存在ACGM多态性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 烟草概述
• 1.1.1 烟草属的分类学地位与烟草栽培种的类型划分
• 1.1.2 普通烟草栽培类型与其主要特点
• 1.2 烟叶主要化学成分及其对吸食品质的影响
• 1.2.1 大量元素
• 1.2.2 微量元素
• 1.2.3 糖
• 1.2.4 蛋白质
• 1.2.5 生物碱
• 1.2.6 致香成分
• 1.3 烟草香气的产生与其相关性状的研究现状
• 1.3.1 影响烟叶香气的因素
• 1.3.2 影响烟叶香气的相关性状
• 1.3.3 与烟叶特征性香气相关的性状遗传研究
• 1.4 烟草分子标记研究进展
• 1.4.1 分子标记概述
• 1.4.2 分子标记在亲缘关系和遗传多样性研究中的应用
• 1.4.3 构建遗传图谱
• 1.4.4 品种纯度鉴定
• 1.4.5 分子标记辅助选择育种
• 1.5 本研究的目的意义、主要内容和技术路线
• 1.5.1 研究目的
• 1.5.2 研究意义
• 1.5.3 研究内容
• 1.5.4 采取的主要技术路线（图示）
• 第二章 烤烟高香气遗传群体的构建及初步定位研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 供试材料
• 2.1.2 感官评价
• 2.1.3 DNA 提取
• 2.1.4 分子标记
• 2.1.5 PCR 扩增和电泳检测
• 2.1.6 数据统计分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 高香气遗传群体的构建
• 2.2.2 感官评价结果
• 2.2.3 多态性标记的筛选及其群体扩增
• 2.2.4 标记的偏分离检验
• 2.2.5 高香气性状的遗传距离
• 2.3 讨论
• 2.3.1 遗传群体的偏分离现象
• 2.3.2 烟草高香气性状的遗传效应
• 第三章 主要栽培类型间烟叶致香成分的比较分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 供试材料
• 3.1.2 致香成分气相色谱（GC）检测
• 3.1.3 香气性状的鉴定评价
• 3.1.4 统计分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 烟叶致香成分检测结果
• 3.2.2 不同类型烟草间的致香成分差异
• 3.2.3 致香成分的聚类分析
• 3.2.4 供试材料香气性状的感官评价
• 3.2.5 基于聚类分析和感官评吸的致香成分差异检测
• 3.3 讨论
• 3.3.1 致香成分对烟草香气风格的影响
• 3.3.2 烟草类型对致香成分的影响
• 3.3.3 特香型烤烟具有的类香料烟特征性高香气具有较高的应用价值
• 第四章 分子标记银染显影方法的优化研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 供试材料
• 4.1.2 DNA 提取
• 4.1.3 分子标记
• 4.1.4 PCR 扩增和电泳方法
• 4.1.5 Bassam 银染方法
• 4.1.6 Sanguinetti 银染方法
• 4.1.7 图像采集和分析方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 两种银染方法的效率和成本比较
• 4.2.2 DNA 标准分子量（Marker）的银染效果比较
• 4.2.3 PCR 扩增产物的染色效果比较
• 4.3 讨论
• 4.3.1 SRAP 和TRAP 标记对银染技术的要求较高
• 4.3.2 Sanguinetti 法更适合分子标记检测
• 4.3.3 计算机软件使分析手段更加灵敏
• 第五章 普通烟草类香料烟特征性香气基因的TRAP 标记研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 供试材料
• 5.1.2 香气性状的鉴定评价
• 5.1.3 总DNA 的提取
• 5.1.4 TRAP 引物设计
• 5.1.5 PCR 扩增反应
• 5.1.6 电泳检测
• 5.1.7 特征带的回收、克隆和测序
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 供试材料香气性状的感官评价结果
• 5.2.2 TRAP 标记在烟草中的扩增效果
• 5.2.3 多态性TRAP 标记筛选
• 5.2.4 烟草类香料烟特征性香气基因TRAP 标记特征带
• 5.2.5 TRAP 特征带的回收测序及其比对结果
• 5.3 讨论
• 5.3.1 TRAP 标记在烟草中的开发应用
• 5.3.2 烟草类香料烟特征性香气基因的遗传鉴定
• 5.3.3 分子标记在烟草遗传育种中的应用
• 第六章 基于e-PCR 的ILP 标记开发研究
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 供试材料
• 6.1.2 烟草基因组数据来源
• 6.1.3 生物信息学分析软件
• 6.1.4 本地化e-PCR 平台的构建
• 6.1.5 电子ILP 标记开发平台的构建
• 6.1.6 ILP 标记的开发策略
• 6.1.7 DNA 提取
• 6.1.8 PCR 扩增
• 6.1.9 电泳检测
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 烟草基因内潜在ILP 位点的初步统计
• 6.2.2 开发策略的验证
• 6.2.3 应用软件进行烟草ILP 标记开发
• 6.2.4 茄科共有序列遗传标记（ACGM）开发初探
• 6.2.5 烟草ILP 标记和茄科ACGM 标记实际扩增效果
• 6.3 讨论
• 第七章 结论
• 参考文献
• 附录1 烟草属分类
• 附录2 ePILP 电子ILP 标记开发平台用户手册
• 附录3 烟草SSR 引物
• 附录4 TRAP 标记特征带序列 BLAST 结果
• 致谢
• 作者简介