聚异戊二烯二苯甲酮诱导的p300和FOXP3的降解机制及其抗肿瘤活性研究

论文摘要

转录因子的翻译后修饰，包括磷酸化，乙酰化，甲基化和泛素化，通过调节稳定性，亚细胞定位，寡聚化或DNA结合能力影响其转录活性。FOXP3赖氨酸残基的乙酰化是一个重要的翻译后修饰，调节Treg细胞内FOXP3的表达水平和功能。目前，已鉴定两种组蛋白乙酰化转移酶（HAT），包括Tip60（Tat-interactiveprotein，也称为KAT5）和p300，可以促进FOXP3的乙酰化。乙酰化的FOXP3对多聚泛素化和蛋白酶体降解更耐受，而且具有更好的染色质结合活性。Garcinol，一种分离于印度藤黄果皮的聚异戊二烯二苯甲酮，是组蛋白乙酰化转移酶p300的天然抑制剂。Garcinol可以抑制p300的自身乙酰化和p300介导的p53（又称为TP53）的乙酰化。最近的研究鉴定了一组复杂的组蛋白乙酰化转移酶之间的相互作用导致了FOXP3功能的增强或抑制。本文采用质粒转染，Western blotting和免疫沉淀实验，用Garcinol作为一种工具，分析了p300调节FOXP3乙酰化的机制。实验结果表明，Garcinol抑制了p300和FOXP3复合物的形成，并促进p300溶酶体降解途径，从而降低了FOXP3乙酰化的水平和最终的降解，蛋白酶体抑制剂MG132并不能抑制Garcinol诱导的降解。在FOXP3乙酰化方面，p300对FOXP3的乙酰化影响较为显著，可以通过影响4个赖氨酸残基影响FOXP3总体乙酰化水平和稳定性。分离于小鼠脾脏的CD4-CD25highTreg细胞和CD4-CD25-CD45RBhighT细胞（效应T细胞，Teff），通过Treg细胞体外抑制实验，研究Garcinol对Treg细胞的功能的影响。实验结果表明，Treg细胞呈剂量依赖性抑制Teff细胞的增殖，并且Garcinol可以抑制Treg细胞的抑制活性。本文通过MTT细胞毒性实验和用neu转化的乳腺癌细胞（H2N113）建立的MMTV-neu转基因小鼠，分别在体外和体内研究了Garcinol和抗肿瘤单克隆抗体7.16.4的协同作用。细胞毒性实验结果表明，7.16.4呈剂量依赖性的抑制H2N113细胞的增殖。Garcinol也可以抑制H2N113细胞的增殖，但不能增强7.16.4的体外抑制活性。小鼠肿瘤模型实验结果表明，高浓度的7.16.4（9mg/kg）本身可以显著抑制肿瘤的生长，低浓度的7.16.4（1.8mg/kg）和Garcinol（43.6mg/kg）本身对肿瘤生长的抑制作用很小，但Garcinol和低浓度的7.16.4的联合应用增强了对肿瘤的抑制作用。这些数据说明Garcinol增强了靶向治疗7.16.4抗体在体内的抗肿瘤活性。本研究证明，可以通过小分子破坏p300的稳定性限制Treg细胞的功能，为癌症的靶向治疗提供了一种新的途径。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一篇 文献综述
• 第一章 Treg 细胞的研究进展
• 1 Treg 细胞的抑制机制
• 1.1 细胞与细胞相互接触
• 1.2 抑制性细胞因子的分泌
• 1.3 生长因子的竞争
• 2 Treg 细胞与肿瘤
• 2.1 肿瘤对 Treg 细胞的募集
• 2.2 Treg 细胞的去除提高了疫苗的疗效
• 第二章 FOXP3 的研究进展
• 1 FOXP3 的结构域
• 1.1 FOXP3 的发现
• 1.2 FOXP3 的结构域
• 2 FOXP3 的翻译后修饰
• 2.1 泛素化和磷酸化
• 2.2 组蛋白介导的 FOXP3 乙酰化的调节
• 第三章 Garcinol 的研究进展
• 1 Garcinol 的结构与化学性质
• 2 Garcinol 的抗癌活性
• 2.1 Garcinol 对炎症通路的影响
• 2.2 Garcinol 对细胞凋亡通路的影响
• 2.3 Garcinol 对表观遗传调控的影响
• 2.4 Garcinol 对增殖，血管生长和转移的作用
• 第二篇 研究内容
• 第一章 FOXP3，p300 蛋白的基因克隆及突变体的构建
• 1 材料
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 p300 突变体（p300F1504A）引物的合成
• 2 方法
• 2.1 PIPHA2-FOXP3a 野生型和突变体质粒和PFLAG-p300 质粒的鉴定
• 2.2 p300 突变体质粒的构建
• 3 结果
• 3.1 PIPHA2-FOXP3a 野生型和突变体质粒和 PFLAG-p300质粒的鉴定结果
• 3.2 目的基因序列测定结果
• 4 讨论
• 4.1 关于FOXP3的赖氨酸残基突变
• 4.2 关于p300乙酰化转移酶活性
• 5 小结
• 第二章 Garcinol对p300 和FOXP3及突变体作用的研究
• 1 材料
• 1.1 细胞株
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 试剂配制
• 2 方法
• 2.1 细胞的培养
• 2.2 质粒的转染和细胞的处理
• 2.3 细胞的裂解，免疫沉淀，Western blotting
• 2.4 免疫共沉淀
• 3 结果
• 3.1 Garcinol诱导了p300 的降解和 FOXP3 乙酰化水平的降低
• 3.2 Garcinol介导的p300和FOXP3 的降解途径
• 3.3 Garcinol介导的FOXP3的降解不依赖于外源表达的p300介导的FOXP3的乙酰化
• 3.4 p300,CBP,P/CAF,Tip60对 Garcinol 敏感性的比较
• 3.5 Garcinol对几个FOXP3突变体的作用
• 4 讨论
• 4.1 Garcinol诱导 p300 的降解导致了FOXP3的低乙酰化
• 4.2 乙酰化转移酶的活性对于 p300 和FOXP3的相互作用并不重要
• 4.3 p300/FOXP3调节中溶酶体的作用
• 4.4 调节 FOXP3乙酰化的调节性赖氨酸残基抑制模型
• 5 小结
• 第三章 Garcinol对Treg 细胞的抑制作用以及与单抗7.16.4 抗肿瘤活性协同作用的研究
• 1 材料
• 1.1 细胞株
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 试剂配制
• 1.5 实验动物
• 2 方法
• 2.1 体外Treg 细胞抑制方法
• 2.2 细胞增殖实验
• 2.3 体内肿瘤实验
• 3 结果
• 3.1 Garcinol抑制Treg 细胞的功能
• 3.2 Garcinol与anti-p185her2/neu 抗肿瘤活性的协同作用
• 4 讨论
• 4.1 关于Her2特异性单抗的癌症治疗
• 4.2 用于癌症治疗的Garcinol，抑制FOXP3和Treg细胞的功能
• 5 小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表的论文
• 导师简介
• Curriculum Vitae
• 致谢