论文摘要
目的:以CtBP1为靶基因,设计并构建能够产生小发卡RNA（shRNA）的重组质粒载体,体外转染人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1(ADR+/+)细胞,采用RNA干扰沉默CtBP1基因,研究其对人子宫内膜癌耐药细胞中MDR1基因表达及P-gp蛋白产生的影响,以及人子宫内膜癌耐药细胞对ADM敏感性的变化,以探讨CtBP1基因在逆转肿瘤多药耐药中的意义。方法:1采用四甲基偶氮唑蓝法（MTT）检测人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1(ADR+/+)的耐药倍数。2采用逆转录-聚合酶链反应（revers transcription PCR, RT-PCR）检测人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1(ADR+/+)和敏感细胞株B-MD-C1（wt）细胞内MDR1基因的表达。3采用免疫印迹技术（western blot）检测人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1(ADR+/+)和敏感细胞株B-MD-C1（wt）细胞内P-gp蛋白的表达。4以CtBP1为靶基因,设计并构建能够产生小发卡RNA（shRNA）的RNA干扰真核表达重组质粒载体,采用脂质体法将重组质粒瞬时转染人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1(ADR+/+)。5采用逆转录-聚合酶链反应（revers transcription PCR, RT-PCR）检测人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1(ADR+/+)重组质粒瞬时转染48小时后细胞内MDR1基因的表达,用于检测RNA干扰是否使MDR1基因沉默。6采用免疫印迹技术（western blot）检测人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1(ADR+/+)重组质粒瞬时转染72小时后细胞内P-gp蛋白的表达,检测RNA干扰是否封闭P-gp蛋白表达。7四甲基偶氮唑蓝法（MTT）检测重组质粒瞬时转染0、24、48和72小时后人子宫内膜癌耐药细胞对ADM敏感性的变化,用于检测RNA干扰能否逆转人子宫内膜癌耐药细胞的多药耐药性。结果:1 ADM对B-MD-C1(ADR+/+)和B-MD-C1（wt）细胞的半数抑制浓度IC50分别为21.57±0.77μg/ml和2.32±0.34μg/ml,B-MD-C1(ADR+/+)细胞耐药倍数约为B-MD-C1（wt）细胞的9.3倍,两者具有非常显著差异（p<0.01）。2 B-MD-C1(ADR+/+)细胞有较强的MDR1基因表达,而B-MD-C1（wt）细胞则未检测到该基因表达,两者具有非常显著差异（p<0.01）。3 B-MD-C1(ADR+/+)细胞中P-gp呈现高表达,而B-MD-C1（wt）细胞中P-gp表达较前者明显减少,两者具有非常显著差异（p<0.01）。4成功设计并构建出两个针对CtBP1基因能够产生shRNA的真核表达重组质粒载体,二者均能够通过RNA干扰作用有效抑制该基因的表达（抑制率分别为47.18%和41.75%）。5重组质粒瞬时转染48小时后细胞内MDR1基因的表达同耐药细胞株B-MD-C1(ADR+/+)相比明显减弱,两者具有显著性差异。6重组质粒瞬时转染72小时后细胞内P-gp蛋白的表达同耐药细胞株B-MD-C1(ADR+/+)相比明显减弱,两者具有显著性差异。7重组质粒瞬时转染24、48和72小时后细胞增殖均受到抑制,其中48、72小时受抑制较明显,与对照组相比具有非常显著差异（p<0.01）。结论:1人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1(ADR+/+)具有明显的耐药性,其耐药机制之一是多药耐药基因MDR1及其表达产物P-gp蛋白的高表达。2设计并构建的shRNA表达载体能够通过RNA干扰有效封闭CtBP1基因的表达。3针对CtBP1的shRNA可以下调人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1(ADR+/+)中MDR1基因及P-gp蛋白的表达。4针对CtBP1的shRNA可以提高人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1(ADR+/+)对AMD的敏感性。
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