论文摘要
研究背景肠屏障功能障碍（Intestine barrier functional disturbance,IBFD）是机体在各种临床危重病、外科手术及严重创伤后的常见并发症,具有较高的发病率,其发生机制尚未完全清楚。目前认为,应激状态下肠黏膜的急性病变涉及肠黏膜保护机制的削弱、损伤因素相对增强以及机体神经内分泌功能失调等诸多方面,是多因素综合作用的结果。肠黏膜屏障损伤及其介导的病理学改变使病情进一步加重。细菌或内毒素可经多途径发生易位,造成肠道细菌易位（bacterial translocation,BT）和肠源性内毒素血症（intestinal endotoxemia）,进而启动全身炎症反应综合征（SIRS）并引起多器官功能障碍综合征（MODS）。研究发现,肠道血运障碍、肠道传输功能受损、炎症介质过度释放、氧自由基损伤、免疫功能损害以及肠黏膜上皮细胞凋亡等因素可能在肠屏障功能损伤机制中起着重要作用。保护肠屏障功能对改善预后具有重要意义。海上作战时伤员落水并浸泡在碱性、高渗海水中是极常见的现象,这是一种严重的应激状态。前期的研究发现,战伤合并海水浸泡具有以下特点:血液出现高钠血症、高氯、高渗状态,以及严重的水、电解质紊乱,伴有代谢性及呼吸性酸中毒。严重的血流动力学紊乱、血液高凝状态、微循环障碍等,极易引发MODS。在海战伤救治的过程中,已经发现有海水浸泡对消化道屏障的破坏,是阻碍成功救治的难题之一。深入研究腹部开放伤合并海水浸泡对肠屏障功能的影响,为有效综合防治IBFD找出相应的对策,是降低早期伤后死亡率不可缺少的重要环节,也是本研究的目的。目的1.建立腹部开放伤合并海水浸泡大鼠模型,观察海水浸泡后大鼠血浆DAO、D-乳酸、LPS及肠道细菌易位的变化和肠黏膜组织形态学改变,确定大鼠肠屏障功能变化情况。2.探讨腹部开放伤合并海水浸泡大鼠肠屏障功能损害的机制:观察肠蠕动速率的变化,肠组织MDA、SOD的含量,血浆TNF-α、IL-6的水平,肠道内容物SIgA、血浆IgA的变化及肠黏膜上皮细胞凋亡的情况。方法1.选择健康雄性Wistar大鼠50只,体重230±20g,清洁级,按照随机化原则分组,每组10只,分组情况如下:A组:腹部开放伤合并海水浸泡组（腹腔开放伤后浸泡于人工海水中）;B组:单纯腹部开放伤组（单纯腹部开放伤后直接观察而不浸泡于海水或生理盐水）;C组:单纯海水浸泡组（大鼠麻醉后未行任何手术,直接将腹部浸泡于人工海水中）;D组:腹部开放伤合并生理盐水浸泡组（腹腔开放伤后浸泡于生理盐水中）;E组:正常对照组（未行任何处理）。2.在腹部开放性创伤和人工海水浸泡双重应激情况下,在应激1小时后,分别用分光光度法检测腹部开放伤合并海水浸泡大鼠血浆DAO和D-乳酸;动态浊度法检测血浆LPS;实验动物脏器细菌定量培养观察细菌易位情况。3.按Haglund等评估小肠黏膜上皮损伤指数的方法,光学显微镜下观察肠黏膜组织病理学改变,透射电镜下观察肠黏膜组织超微结构变化。4.采用活性炭标记法测定大鼠肠道蠕动速率,分光光度法检测肠组织MDA和SOD,酶联免疫吸附测试（ELISA）法检测血浆TNF-α、IL-6、IgA和肠道内容物SIgA。结果1.血浆D-乳酸活性检测:腹部开放伤合并海水浸泡组（A组）大鼠血浆D-乳酸活性（7.63±0.72 mg/L）、单纯腹部开放伤组（B组）血浆D-乳酸活性（5.46±0.57mg/L）、腹部开放伤合并生理盐水浸泡组（D组）血浆D-乳酸活性（4.97±0.95mg/L）较正常对照组（E组）大鼠血浆D-乳酸活性（4.06±0.39 mg/L）显著升高（P＜0.01）,单纯海水浸泡组（C组）血浆D-乳酸活性（3.89±0.55mg/L）较E组无显著差异（P＞0.05）;与B组比较,D组血浆D-乳酸活性无显著差异（P＞0.05）,A、C组血浆D-乳酸活性有显著差异（P＜0.01）。2.血浆DAO活性检测:大鼠血浆DAO活性A组（6.24±1.54 KU/L）、B组（3.57±1.65 KU/L）、C组（0.42±0.04KU/L）、D组（3.40±1.58KU/L）较E组（0.36±0.04 KU/L）均显著升高（P＜0.01）;而与B组比较,D组无显著差异（P＞0.05）,A、C组有显著差异（P＜0.01）。3.血浆内毒素水平检测:大鼠血浆内毒素水平A组（486.5±116.1 pg/ml）、B组（344.5±51.5 pg/ml）、D组（338.7±54.4 pg/ml）较E组（23.5+10.4 pg/ml）显著升高（P＜0.01）,C组（23.0±11.7pg/ml）与E组无显著差异（P＞0.05）;与B组比较,A、C组血浆内毒素有显著差异（P＜0.01）,D组无显著差异（P＞0.05）。4.实验动物脏器细菌定量培养:结果显示,正常动物在无菌条件下采集的血浆标本和其他脏器匀浆液标本经细菌培养后,没有菌落出现;A、B、D组血浆、肝脏及肠系膜淋巴结细菌培养后均可见大量菌落出现;与B组相比,A组和D组血培养及肝脏培养菌落数显著上升,且A组结果最高,肠系膜淋巴结培养,D组菌落数显著减少,A组菌落数无明显差异。5.小肠黏膜组织形态学观察及评分:C、E组肠黏膜未见损伤,光镜下黏膜结构完整,小肠绒毛上皮完整、细胞排列整齐;A、B、D组均引起多部位的不同程度的肠道损伤,小肠绒毛顶端水肿、间隙增宽;部分区域上皮细胞萎缩,细胞核固缩、碎裂,胞浆嗜酸性变;固有膜毛细血管扩张,红细胞凝聚;淋巴管扩张,淋巴管内淋巴细胞聚集。小肠黏膜损伤评分值分别为:A组（5.10±0.74）;B组（2.20±0.78）;C组（0.20±0.42）;D组（2.50±0.71）;E组（0.20±0.42）。A、B、D组损伤程度评分显著高于C、E组（P＜0.01）;与B组比较,A组肠黏膜组织损伤程度明显加重（P＜0.01）,B组和D组间无显著差异（P＞0.05）。6.小肠组织电镜观察:透射电镜下,C、E组大鼠肠上皮细胞微绒毛结构完整,排列整齐,胞浆内含大量线粒体,结构完整,嵴清晰;A、B、D组肠道损伤后肠上皮细胞微绒毛变短,排列不整齐,线粒体肿胀明显,部分嵴溶解消失,较大空泡形成;部分细胞核固缩,核膜表面凹凸不平,染色质集聚于核膜周边形成新月形或环形,呈凋亡的形态改变。7.肠蠕动速率检测:检测肠蠕动速率活性炭标记法简单准确。大鼠肠道蠕动速率A组（15.36±1.63%）显著下降（P＜0.01）,其蠕动速率只为E组（77.94±3.68%）的20%。B组（22.94±0.95%）、C组（32.34±3.58%）、D组（21.30±3.56%）肠蠕动速率显著低于E组（P＜0.01）,与E组比较,腹部开放伤及海水浸泡能够非常显著地抑制肠道蠕动功能;与B组比较,D组无显著差异（P＞0.05）,A、C组抑制肠道蠕动功能有显著差异（P＜0.01）。8.血浆TNF-α浓度检测:大鼠血浆TNF-α浓度A组（105.20±21.17 pg/ml）、B组（68.43±20.09 pg/ml）、C组（67.77±16.57 pg/ml）、D组（57.25±14.21 pg/ml）较E组（40.24±10.29 pg/ml）显著升高（P＜0.05）;而与B组比较,A组血浆TNF-α浓度显著升高（P＜0.01）,C、D组无显著差异（P＞0.05）。9.血浆IL-6浓度检测:大鼠血浆IL-6浓度A组（207.76±42.26 pg/ml）、B组（136.37±27.57 pg/ml）、D组（143.58±33.76 pg/ml）较E组（94.98±17.84 pg/ml）显著升高（P＜0.05）,C组（107.02±26.09 pg/ml）较E组无显著差异（P＞0.05）;而与B组比较,A、C组血浆IL-6浓度有显著差异（P＜0.05）,D组无显著差异（P＞0.05）。10.肠内容物SIgA含量检测:与E组（99.6±16.7 mg/L）比较,A组（32.26±7.57mg/L）、B组（65.08±10.07 mg/L）、D组（45.84±9.41 mg/L）肠道内容物SIgA含量显著减少（P＜0.01）,C组（89.98±11.14 mg/L）无显著差异（P＞0.05）;与B组比较,A、C、D组肠道内容物SIgA含量有显著差异（P＜0.01）。11.血浆IgA含量检测:与E组（61.73±17.44 mg/L）比较,A组（32.10±10.84 mg/L）、B组（43.62±10.12 mg/L）、D组（38.68±12.98 mg/L）血浆IgA含量显著减少（P＜0.01）,C组（65.84±8.18 mg/L）无显著差异（P＞0.05）;与B组比较,A、D组无显著差异（P＞0.05）,C组有显著差异（P＜0.01）。12.大鼠肠组织MDA含量检测:腹部开放海水浸泡后,肠上皮细胞应激反应造成肠组织MDA含量明显增加;与E组（2.76±1.97 nmol/mg pro）比较,A组（4.70±1.17 nmol/mg pro）、B组（3.14±0.65 nmol/mg pro）、D组（4.37±1.32 nmol/mgpro）大鼠肠组织MDA含量显著升高（P＜0.01）,C组（2.13±1.08 nmol/mg pro）大鼠肠组织MDA含量无显著差异（P＞0.05）;与B组比较,A、C、D组大鼠肠组织MDA含量有显著差异（P＜0.05）。13.大鼠肠组织SOD含量检测:腹部开放伤合并海水浸泡后,肠上皮细胞应激反应造成肠组织SOD含量明显减少;与E组（4.31±1.40 NU/mg pro）比较,A组（1.57±0.34 NU/mg pro）、D组（2.05±0.43 NU/mg pro）大鼠肠组织SOD含量显著减少（P＜0.01）,B组（3.43±1.33 NU/mg pro）、C组（4.09±1.70 NU/mg pro）大鼠肠组织SOD含量无显著差异（P＞0.05）;与B组比较,A、D组大鼠肠组织SOD含量显著减少（P＜0.01）,C组大鼠肠组织SOD含量无显著差异（P＞0.05）。14.小肠黏膜上皮细胞凋亡检测:TUNEL法显示,凋亡细胞主要位于小肠绒毛顶部,且随致伤程度的加重有由上向下发展的趋势。C、E组小肠黏膜绒毛顶部可见少量阳性凋亡细胞。A、B、D组小肠黏膜绒毛及隐窝上皮细胞凋亡明显增多。小肠黏膜上皮细胞凋亡指数的变化分别为:A组（45.60±7.0）,B组（22.10±3.6）,C组（5.10±0.6）,D组（24.66±3.5）,E组（4.51±0.7）。C、E组小肠黏膜上皮细胞凋亡指数呈现低水平;A、B、D组小肠黏膜上皮细胞凋亡指数均显著高于C、E组（P＜0.05）;与B组比较,A组小肠黏膜上皮细胞凋亡指数显著增高（P＜0.01）,D组无显著差异（P＞0.05）。结论1.大鼠腹部开放伤合并海水浸泡动物模型制作成功;腹部开放伤及腹腔海水浸泡双重应激可引起IBFD,肠黏膜通透性增高;出现肠源性内毒素血症和细菌易位,成为创伤后肠源性感染及多器官功能障碍综合征（MODs）发生的原因之一。2.腹部开放伤合并海水浸泡大鼠肠道蠕动功能明显受到抑制,出现肠道动力障碍,肠道传输功能受损是肠源性内毒素血症和细菌易位的原因之一。3.腹部开放伤合并海水浸泡可导致大鼠肠黏膜屏障功能受损,TNF-α、IL-6等炎症介质及氧自由基参与了腹部开放伤合并海水浸泡继发性炎症反应过程及肠道黏膜细胞损伤。4.腹部开放伤合并海水浸泡大鼠肠道免疫功能下降。大量的肠黏膜上皮细胞凋亡是细菌易位和肠源性内毒素血症的重要机制之一。肠道局部免疫功能的紊乱可能是引起整个机体免疫功能紊乱的原因之一。
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