论文摘要
近几十年来,随着临床上抗恶性肿瘤药物、免疫抑制剂、广谱抗生素的广泛使用,肿瘤化疗、放疗、腹膜透析、器官移植的普遍开展,以及免疫缺陷性疾病尤其是艾滋病的广泛迅速蔓延,白念珠菌、新生隐球菌和烟曲霉菌等深部真菌感染的发病率急剧上升。深部真菌感染在临床上现已成为艾滋病和恶性肿瘤等重大疾病死亡的重要原因,已上升为第三大传染性疾病,严重威胁着人类的生命健康。抗真菌药物研究一直是全球药物学家关注的重点领域之一。目前,临床上用于治疗深部真菌感染的药物相对较少,并且存在抗菌谱窄和严重的耐药性两大主要问题。因此,临床上迫切需要新型的安全、高效、抗菌谱广、抗耐药的抗真菌药物。以氟康唑和伊曲康唑为代表的氮唑类抗真菌药物（又称为羊毛甾醇14α去甲基化酶抑制剂,CYP51抑制剂）是目前临床上治疗深部真菌感染应用最广泛的药物之一,由于其高效、低毒的优越性,目前已成为临床上用于治疗深部真菌感染的一线用药。其作用机制主要是通过抑制真菌麦角甾醇（真菌细胞膜的主要成分）生物合成途径中24-亚甲基双氢羊毛甾醇的14α去甲基化反应,从而抑制真菌的生长。由于氮唑类化合物在临床应用中表现出的优越性,氮唑类抗真菌药物研究已成为抗真菌药物研究中的热点之一。依据氮唑类抗真菌药物构效关系研究结论,通过计算机模拟对接,设计了一系列目标化合物,这些化合物保留了三唑类抗真菌化合物基本药效基团:1,2,4-三氮唑环、2,4-二氟苯基和叔醇结构。以间二氟苯为起始原料,经傅-克反应与氯乙酰氯反应制得ω-氯代-2, 4-二氟苯乙酮,然后在甲苯中与三唑反应形成2,4-二氟-2-（1H-1,2,4-三唑-1-基）苯乙酮,然后与硫伊立德（ylid）试剂三甲基氧硫碘化物发生亲核加成反应,形成环氧化物,再与甲烷磺酸成盐,得关键中间体1-[2-（2,4-二氟苯基）-2,3-环氧丙基]-1H-1,2,4-三唑甲烷磺酸盐。中间体与不同胺开环反应,制备1-（1H-1,2,4-三唑-1-基）-2-（2,4-二氟苯基）-3-（N-取代氨基）-2-丙醇。在乙腈中以碳酸钾作为缚酸剂和溴丙炔反应生成1-（1H-1,2,4-三唑-1-基）-2-（2,4-二氟苯基）-3-（N-取代氨基-N-炔丙基氨基）-2-丙醇,最后在二甲亚砜溶剂中,叠氮化钠和各种取代溴苄反应制得叠氮化物,不经处理直接加入1-（1H-1,2,4-三唑-1-基）-2-（2,4-二氟苯基）-3-（N-取代氨基-N-炔丙基氨基）-2-丙醇,以硫酸铜和抗坏血酸钠为催化剂,通过“Click Reaction”来制备各类目标化合物,在母核的另一侧通过“Click Reaction”再次引入一个1,2,3-三氮唑环,这在抗真菌药物设计当中属于首次尝试,共设计合成了在侧链N原子上以甲基、乙基、丙基、正丁基、环丙基、异丙基、烯丙基等取代的8类157个新型三氮唑类抗真菌化合物。经文献检索,所有化合物均为首次报道。目标化合物的结构都经过1H NMR确证,部分化合物经过13C NMR和MS确证。参照美国国家临床实验室标准委员会（NCCLS）提出的标准化抗真菌敏感性实验方法,对所合成目标化合物和个别中间体进行了体外抑菌活性的测试,共选择了8种真菌:白念珠菌（Candida albicans）SC5314、新生隐球菌（Cryptococcus neoformans）ATCC32609、近平滑念珠菌（Candida parapsilosis）、热带念珠菌（Candida tropicalis）、红色毛癣菌（Trichophyton rubrum）、克柔念珠菌（Candida kefyr）、白念珠菌（Candida albicans）Y0109、薰烟曲霉菌（Aspergillus fumigatus）;并以氟康唑（FCZ）、伊曲康唑（ICZ）、酮康唑（KCZ）、特比萘芬（TBR）、沃力康唑（VCZ）和两性霉素B作为阳性对照药。初步的体外抑制真菌活性实验结果表明:所有目标化合物和中间体对8种真菌都具有一定的抑制活性,除了对烟曲霉菌效果不佳外。其中化合物B10,C2,F19,F21和G7对白色念珠菌（Candida albicans）SC5314的抑制活性(MIC80: 0.0039μg/mL)是氟康唑活性的128倍,化合物A12,A16,C16,C25,F4和F13对白念珠菌（Candida albicans）Y0109的抑制活性(MIC80: 0.0039μg/mL)是氟康唑活性的128倍;化合物G7对白念珠菌（Candida albicans）Y0109的抑制活性(MIC80: 0.00097μg/ml)是氟康唑的512倍;化合物D5,E15和F8对克柔念珠菌（Candida kefyr）的抑制活性(MIC80: 0.0039μg/mL)是氟康唑的256倍;有进一步的研究价值。GM3是一种含有唾液酸的三糖抗原,在许多肿瘤细胞中广泛表达,因此成为设计治疗性肿瘤疫苗的热门靶标。然而,在基于GM3的肿瘤疫苗的开发上存在的一个严重问题是GM3的抗原性极差。为了克服这个问题,我们设计合成了四种GM3的衍生物,包括N-5’位对甲基苯乙酰基、对甲氧基苯乙酰基、对乙酰基苯乙酰基和对氯苯乙酰基等取代基取代的GM3,然后将它们偶联到一个载体蛋白,钥孔血蓝蛋白（Keyhole Limpet Hemocyanin KLH）上形成糖蛋白复合物。这些复合物作为疫苗在小鼠进行了免疫学测试。本研究采用已经被实验证实具有高度免疫原性的GM3衍生物,N-5’位苯乙酰基取代的GM3 （GM3NPhAc）KLH复合物作为对照。实验表明,我们所设计合成的四种新的GM3衍生物具有比GM3 （GM3NPhAc）更好的免疫原性和较强的肿瘤免疫治疗所需要的T细胞免疫反应活性。综上所述,设计合成的这些新型GM3衍生物是一类非常有前景的肿瘤疫苗候选物,可以结合糖细胞工程用于肿瘤免疫治疗。
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