蛋白药物用于药物涂层支架的研究

论文摘要

以死亡率计,冠状动脉粥样硬化为代表的心血管疾病至今仍是人类健康的第一杀手。在冠状动脉腔内植入支架是对于该类疾病进行非手术治疗的主要手段,而将药物载于支架在病变部位缓慢释放则是避免支架植入后血管再狭窄的必要措施。目前临床上用于药物涂层支架的多为化学小分子药物,其在抑制平滑肌增殖的同时,也抑制内皮细胞的生长,造成再内皮化大幅度延迟,以及急性或亚急性血栓等问题,使得药物涂层支架的应用存在着潜在的危险。蛋白药物因其生物特异性,有可能选择性地抑制平滑肌或促长血管内皮,引起了科学家的关注和研究投入,报道了一些有前景的蛋白药物,为药物涂层支架的研究提出了一些新的思路,显示了这一领域的技术可行性。但对于持有脆弱三级结构的蛋白药物来说,将蛋白大分子药物固定化在支架表面并且缓慢地释放于治疗部位在技术上具有一定的难度和挑战。本研究提供了一个可以安全有效地将足够剂量的蛋白药物均匀地组合于高分子涂层的基质中的方法,即将我们自行开发的新型材料体系:稳定的水相-水相乳液技术及其基础上制备的蛋白质-多糖玻璃体应用于支架涂层上,在有效保护蛋白活性的同时实现蛋白的缓控释,着眼于从制剂工艺的角度解决再狭窄问题。本研究是以牛血清白蛋白为模型,通过稳定的水相-水相乳液技术将其制备成多糖玻璃体颗粒,并将多糖玻璃体颗粒分散于聚乳酸的二氯甲烷和乙酸乙酯（1:1）溶液中,喷涂于316L不锈钢支架表面制成蛋白涂层支架,用SEC-HPLC比较了蛋白涂层支架制备前后蛋白的聚集情况,并用扫描电镜等对蛋白涂层支架表面进行了表征。将制备的蛋白涂层支架在水浴摇床以37°C磷酸盐缓冲液（PBS）为介质进行体外释放动力学研究,按规定的时间间隔取样后用MicroBCA试剂盒测定,并考察了控释层厚度,高分子涂层（PLA、PLGA）,蛋白葡聚糖比例,蛋白种类等因素对蛋白体外释放的影响。在对蛋白涂层支架条件有所把握的基础上,本文考察了将具有促血管生成作用的促红细胞生成素（EPO）应用于心脏涂层支架的可行性,建立了EPO效价检测方法,比较了EPO涂层前后蛋白聚集情况,并采用效价检测方法测定了EPO体外释放动力学。结果表明蛋白涂层支架在电镜观察下外观圆整,表面光滑,制剂过程中未产生蛋白聚集,且蛋白担载量高,能从涂层中缓慢释放达50天以上。蛋白释放速度随着控释层的厚度增加而减慢。PLGA涂层的释放速度明显较PLA涂层快。制备多糖玻璃体颗粒时葡聚糖/蛋白的比例越高,蛋白释放的突释越小。以该法制备的蛋白涂层支架,蛋白的性质不同对释放行为影响不大。EPO涂层支架亦能保护EPO在涂层和释放过程中的活性,且实现缓释。稳定的水相-水相乳液技术及其基础上制备的蛋白多糖玻璃体颗粒应用于心脏支架涂层上,能在有效保护蛋白构象的同时实现蛋白的缓释,为具有抗再狭窄活性蛋白应用于心脏支架提供了技术平台。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1. 研究背景
• 1.2. 国内外研究现状
• 1.2.1. 血管内皮生长因子VEGF（Vascular Endothelial Growth Factor）
• 1.2.2. EPC（内皮祖细胞）抗体
• 1.2.3. 血小板膜糖蛋白IIb/IIIa 单克隆抗体
• 1.2.4. 活性蛋白C（Activated Protein C）
• 1.3. 研究思路与试验方案
• 第二章 蛋白涂层支架的制备与表征
• 2.1 仪器与试剂
• 2.1.1. 主要仪器设备
• 2.1.2. 主要试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1. 蛋白-葡聚糖玻璃体微粒制备
• 2.2.2. 蛋白涂层方法的建立
• 2.2.3. 蛋白涂层支架的表面形态研究
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 蛋白多糖玻璃体颗粒的表征
• 2.3.2 涂层高分子溶剂以及浓度的选择
• 2.3.3 支架涂层条件的控制
• 2.3.4 蛋白涂层支架表面表征
• 2.4 小结
• 第三章 蛋白涂层支架回收蛋白聚集体研究
• 3.1. 仪器与试剂
• 3.1.1. 主要仪器设备
• 3.1.2. 主要试剂
• 3.2. 实验方法
• 3.2.1. 蛋白聚集体检测法－SEC-HPLC 的建立
• 3.2.2. 回收蛋白聚集体测定
• 3.3. 结果与讨论
• 3.4. 小结
• 第四章 蛋白涂层支架体外释放动力学研究
• 4.1. 仪器与试剂
• 4.1.1. 主要仪器设备
• 4.1.2. 主要试剂
• 4.2. 实验方法
• 4.2.1. 蛋白含量测定方法的建立
• 4.2.2. 蛋白涂层支架涂层方法的建立
• 4.2.3. 体外释放度实验方法
• 4.2.4. 体外释放影响因素考察
• 4.3. 结果与讨论
• 4.3.1. 蛋白含量测定标准曲线
• 4.3.2. 支架与不锈钢网片涂层释放曲线比较
• 4.3.3. 控释层对蛋白释放的影响
• 4.3.4. 不同高分子涂层对蛋白释放的影响
• 4.3.5. 蛋白葡聚糖比例对蛋白释放的影响
• 4.3.6. 不同蛋白涂层释放曲线比较
• 4.3.7. 蛋白涂层支架体外释放动力学
• 4.4. 小结
• 第五章 促红细胞生成素在药物涂层支架上的应用
• 5.1. 仪器与试剂
• 5.1.1. 主要仪器设备
• 5.1.2. 主要试剂
• 5.2. 实验方法
• 5.2.1. UT-7 依赖性生长EPO 活性标准曲线的建立
• 5.2.2. EPO 涂层支架制备
• 5.2.3. EPO 涂层支架蛋白回收聚集体研究
• 5.2.4. EPO 涂层支架体外释放动力学研究
• 5.3. 结果与讨论
• 5.3.1. EPO/UT-7 标准曲线
• 5.3.2. EPO 涂层支架回收蛋白聚集体研究
• 5.3.3. EPO 涂层支架体外释放动力学
• 5.4. 小结
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文